重組巴斯德畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的研究.pdf

1、幾丁質(zhì)廣泛分布于動(dòng)物、微生物體內(nèi)，是自然界中含量?jī)H次于纖維素的生物多聚物，年生物合成量達(dá)100億噸。作為自然界中唯一大量合成的堿性多糖，其具有很多不同于其他多糖的特性，并顯現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，是糖生物學(xué)開發(fā)應(yīng)用研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)能將幾丁質(zhì)β-1，4糖苷鍵水解，最終分解為N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)。在作物抗真菌病害、人類治療真菌病、幾丁質(zhì)深加工等領(lǐng)域前景看好。因此，幾丁質(zhì)酶的批量生產(chǎn)勢(shì)在必行

2、。本研究的內(nèi)容即是采用一株Mut<'+>表型的重組巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)水稻堿性幾丁質(zhì)酶，對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析。 試驗(yàn)在搖瓶水平對(duì)巴斯德畢赤酵母表達(dá)幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了研究，得到的結(jié)果為：培養(yǎng)基以有機(jī)培養(yǎng)基BMMY為宜；離心與否對(duì)外源蛋白表達(dá)影響不大；添加0.5％的(NH<,4>)<,2>SO<,4>、0.05％的油酸、添加1.0％的甲醇混合0.1％的甘油、0.67％的YNB、1.5％的酵母抽提物、pH6.

3、0、每12 h補(bǔ)加一次甲醇、誘導(dǎo)108 h，重組幾丁質(zhì)酶表達(dá)量最高，提高甲醇濃度穩(wěn)定性有利于蛋白表達(dá)量的提高；而添加氧載體抑制外源蛋白表達(dá)；表面活性劑誘導(dǎo)雜蛋白分泌;降低誘導(dǎo)溫度不利于重組幾丁質(zhì)酶的表達(dá)。可以此作為發(fā)酵罐培養(yǎng)流加成分的參考。 在7 L發(fā)酵罐進(jìn)行了放大試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株利用甲醇能力較強(qiáng)，完全能夠以溶氧振蕩為指針指示甲醇流加，通過蠕動(dòng)泵連續(xù)流加甲醇誘導(dǎo)，外源蛋白表達(dá)量峰值比搖瓶誘導(dǎo)提前了近24 h，在84 h蛋白表達(dá)量

4、達(dá)462.41 mg/L，單位得率提高了近2.7倍；幾丁質(zhì)酶酶活達(dá)到77.61 U/mL。 為進(jìn)一步提高幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量，在誘導(dǎo)階段進(jìn)行了甘油-甲醇混合碳源流加策略和甘油-甲醇交替流加策略。甘油．甲醇混合流加過程中甘油的限制性流加改善了菌體生長(zhǎng)狀況，菌體密度達(dá)到一個(gè)更高的水平，酵母生理活性的提高使誘導(dǎo)期得以延長(zhǎng)，帶動(dòng)甲醇進(jìn)一步誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到了495.33 mg/L，幾丁質(zhì)酶酶活達(dá)到88.31 U/mL;甘油-甲醇碳源交

5、替流加策略打破了畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)AOX1的平衡，延緩了酵母細(xì)胞內(nèi)AOX1飽和的時(shí)間，外源蛋白表達(dá)速率下降的趨勢(shì)得以緩解，在120 h外源蛋白最高表達(dá)量達(dá)到516.45 mg/L，幾丁質(zhì)酶酶活達(dá)到99.3 U/mL。 對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行了硫酸銨分級(jí)沉淀和Sephadex G-100柱層析，得到純化的幾丁質(zhì)酶。發(fā)現(xiàn)該幾丁質(zhì)酶對(duì)熱不敏感：在酸性pH范圍內(nèi)酶活性較高，并且表現(xiàn)為雙峰型，在堿性pH中酶活性降低，印證巴斯德畢赤酵母正確表達(dá)了水稻