利用重組巴斯德畢赤酵母高效生產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的研究.pdf

1、S-腺苷蛋氨酸,又名S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,簡稱SAM)。它是一種廣泛存在于植物、動物、微生物體內(nèi)的重要生理活性物質(zhì),具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫基、轉(zhuǎn)氨丙基等作用,參與了40多種生化反應(yīng),緊密聯(lián)系著蛋白質(zhì)、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、磷脂質(zhì)以及維生素的合成,而且還與多胺和谷胱甘肽的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。
　　 研究表明,S-腺苷蛋氨酸對肝病、抑郁癥、關(guān)節(jié)炎、纖維性肌痛、偏頭痛等疾病具有治療作用。此外,SAM還可以治療

2、阿爾茨海默氏癥、癲癇、帕金森氏病、亞急性脊髓變性以及HIV引起的神經(jīng)性并發(fā)癥等?；赟AM的重要生理功能和廣泛應(yīng)用,研究大規(guī)模高產(chǎn)量制備SAM的關(guān)鍵工程技術(shù)成為迫切需要解決的問題。目前,SAM的生產(chǎn)制備方法主要有化學(xué)合成法、酶促轉(zhuǎn)化法、發(fā)酵法和全細(xì)胞催化法四種。利用重組酵母細(xì)胞在培養(yǎng)基中加入前體L-甲硫氨酸進(jìn)行發(fā)酵是目前工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)SAM的主要方法。
　　 本研究首先通過在巴斯德畢赤酵母GS115中導(dǎo)入SAM合成酶基因sam2以

3、及敲除胱硫醚合成酶基因cbs這兩條途徑,對菌株進(jìn)行改造,共得到GS115、ZJGSU1、ZJGSU2和ZJGSU3四種菌株。通過高效液相色譜分析,其搖瓶產(chǎn)量分別達(dá)到了0.010 g/L、0.804 g/L、0.131 g/L、1.152 g/L,為大量制備SAM奠定重要基礎(chǔ)。
　　 在搖瓶水平上考察了L-甲硫氨酸、甲醇、pH值、接種量、裝液量、油酸以及PTM1這7個因素對高產(chǎn)菌株ZJGSU3中SAM產(chǎn)量的影響。在此基礎(chǔ)上通過2-

4、level Factorial實驗設(shè)計,確定影響SAM產(chǎn)量的關(guān)鍵因子為甲醇、pH值和裝液量。選取這三個因子進(jìn)行Box-Behnken實驗設(shè)計,確定其產(chǎn)SAM的最佳條件。結(jié)果表明:當(dāng)甲醇添加量為1.5％,pH為5.0,裝瓶量為30 mL/500 mL時,SAM產(chǎn)量可達(dá)到最高值。采用Design-expert7.0軟件進(jìn)行設(shè)計和分析后,得到最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:1.00％酵母膏,2.00％蛋白胨,1.34％YNB,1.0％L-met,100

5、 mM磷酸鹽緩沖液,1.40％甲醇,0.10％油酸,0.4％PTM1以及4.00×10-5％生物素;最佳培養(yǎng)條件為:pH5.0,接種量5％,裝瓶量30 mL/500 mL。在此培養(yǎng)條件下培養(yǎng)84 h后,SAM產(chǎn)量達(dá)到最高值3.23 g/L,對比優(yōu)化前的1.15 g/L,增加了1.8倍;與原始菌相比,其產(chǎn)量增加了300多倍。最后,對重組高產(chǎn)菌株ZJGSU3進(jìn)行上罐擴(kuò)大培養(yǎng)。通過重組菌ZJGSU35 L發(fā)酵罐四個階段(預(yù)培養(yǎng)、甘油流加、碳源