巴斯德畢赤酵母新型分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf_第1頁(yè)
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1、用化學(xué)合成的方法合成INUA、INUB、INUC三個(gè)先導(dǎo)肽DNA片段, 經(jīng)BamHI和EocRI酶切后,與同樣雙酶切處理的質(zhì)粒pPIC3.5K重組構(gòu)建得到一個(gè)套具有INU 先導(dǎo)序列的新型分泌型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)即pPICINUA,pPICINUB,pPICINUC.設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物, 用PfuDNA聚合酶從大腸桿菌基因組上PCR擴(kuò)增出天冬酰成熟肽基因序列(簡(jiǎn)稱(chēng)ASN序列), 經(jīng)EcoRI酶處理后插入pPICINUA和pPIC9K中,得到

2、表達(dá)質(zhì)粒pPICINUA-ASN和pPIC9K-ASN,將這兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒與空白質(zhì)粒pPIC9K經(jīng)SacI酶切線(xiàn)性化后用原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化入Pichiapastoris的GS115菌株中, 經(jīng)過(guò)篩選得到5個(gè)Mut<'+>型菌株即GS115/INUA-ASN0.25、GS115/INUA-ASN4.0、GS115/9K-ASN0.25、GS115/9K-ASN4.0和GS115/pPIC9K,將這五個(gè)菌株與GS115/β-Gal一起用甲醇培養(yǎng)基

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