sarscovs1基因的巴斯德畢赤酵母表達(dá)及阻斷多肽的研究

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文SARSCoVS1基因的巴斯德畢赤酵母表達(dá)及阻斷多肽的研究姓名：盧海松申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)指導(dǎo)教師：郭愛(ài)珍20060601SARSCoVSl基因的巴斯德畢赤酵母表達(dá)及阻斷多肽的研究摘要嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)又稱“非典型性肺炎”，或“非典”，主要表現(xiàn)為肺炎及漸進(jìn)性呼吸衰竭，死亡率為10％左右。它于2002年11月在中國(guó)廣東省首先爆發(fā)

2、，然后迅疾傳播至全球32個(gè)國(guó)家及地區(qū)，其病原為一種新的冠狀病毒(SARSassociatedcoronavirus，SARSCoV)。目前尚無(wú)特效藥物用于SARS治療，正在研究的各種抗病毒方法包括：用模擬受體分子或病毒的受體結(jié)合蛋白封閉病毒受體相互作用、用小肽分子抑制病毒與細(xì)胞膜間的融合、用特定中和表位研制亞單位疫苗等。SARSCoV刺突蛋白sl是與病毒主要受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensinconvertingenzyme2

3、。ACE2)相結(jié)合的病毒蛋白，其受體結(jié)合功能區(qū)包括在第318，510個(gè)氮基酸殘基間的193個(gè)氨基酸片段內(nèi)，該片段同時(shí)包含多個(gè)中和表位。本研究通過(guò)克隆表達(dá)SARSCoV的S1蛋白受體結(jié)合區(qū)，用表達(dá)的sl蛋白為靶蛋白，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)中篩選特異性結(jié)合多肽，篩選阻斷多肽。為進(jìn)一步研究病毒致病機(jī)理及抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。本研究通過(guò)對(duì)Sl基因修飾，在編碼氨基酸不發(fā)生改變的前提下設(shè)計(jì)多對(duì)引物采用OverLapPCR對(duì)含有受體結(jié)合區(qū)的S1基因(7

4、771683，10411050，1236一1248，13171335，15901605)位存在的多個(gè)AT重復(fù)序列進(jìn)行核苷酸置換。修飾后的sl基因克隆于酵母表達(dá)載體pPIC9K中，誘導(dǎo)上清經(jīng)過(guò)SDSPAGE和WesternBlot檢測(cè)，證實(shí)Sl蛋白在巴斯德畢赤酵母中獲得了表達(dá)。紫外分光光度計(jì)測(cè)定Sl蛋白在酵母表達(dá)產(chǎn)量為69mg／L，說(shuō)明巴斯德畢赤酵母是一種適合s1蛋白表達(dá)的系統(tǒng)。表達(dá)的sl蛋白作為診斷抗原檢測(cè)入的陽(yáng)性血清，ELISA結(jié)果證