一種抗菌多肽的畢赤酵母表達(dá)的初步研究.pdf

1、上海高科聯(lián)合生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成的抗菌肽GK8具有良好的殺菌活性，前期已人工合成了一定量的純品，同時(shí)對(duì)GK系列抗菌肽也進(jìn)行了大腸桿菌的融合表達(dá)。這為本文開(kāi)展GK8畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究創(chuàng)造了條件。選用的巴氏畢赤酵母不但具有原核生物易培養(yǎng)、操作便利等特點(diǎn)，又具有真核生物蛋白翻譯后加工的能力；同時(shí)具有高表達(dá)、高穩(wěn)定和高分泌等優(yōu)點(diǎn)。其表達(dá)質(zhì)粒屬于分泌型，便于提取和純化。
　　 本研究在由上海生工生物工程有限公司訂購(gòu)的質(zhì)粒pUC57

2、-GK8和設(shè)計(jì)的引物P1、P2的基礎(chǔ)上，以pUC57－GK8質(zhì)粒DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定該質(zhì)粒的可靠性。將含有pUC57-GK8質(zhì)粒大腸桿菌DH5α進(jìn)行大量表達(dá)。經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆用于構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-GK8。重組質(zhì)粒pPIC9K－GK8電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，通過(guò)G418篩選和雙酶切鑒定選擇轉(zhuǎn)化了pPIC9K－GK8的畢赤酵母菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集畢赤酵母分泌表達(dá)的目標(biāo)產(chǎn)物GK8。通過(guò)SDS-PAGE電泳和