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文檔簡介
1、趨化因子(chemokine)是指對于炎性細胞具有趨化作用的一類小分子蛋白,根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)中4個位點上的半胱氨酸殘基的分布以及附近氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)分為CXC、CC、C和CX3C四種類[1]。趨化因子RANTES是趨化性細胞因子CC亞族成員(CCL5),其分子量為8KD,N端沒有糖基化位點,許多細胞如NK細胞和γδT細胞[2]都可組成性表達RANTES。趨化因子RANTES通過結(jié)合細胞表面的趨化因子受體誘發(fā)致炎性免疫應(yīng)答[3]。RANTE
2、S能夠誘導(dǎo)白細胞向炎癥部位浸潤,是一種典型的趨化性細胞因子,也是有效的白細胞激活劑,參與很多炎癥反應(yīng)。在很多疾病的病理生理過程中起著重要作用,如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、器官移植排斥、心腦血管疾病、腫瘤以及HIV等,為臨床治療這些疾病展示了誘人前景。然而,從天然組織中分離RANTES有限,難以滿足對其生物學(xué)功能研究和臨床應(yīng)用的需要。因此,運用基因工程方法生產(chǎn)RANTES,具有一定的研究和應(yīng)用價值。
本實驗嘗試使用具備真核細胞
3、蛋白翻譯后加工機制和較強分泌表達能力,同時又具備操作簡單,遺傳背景清楚,廉價等優(yōu)點的低等真核表達系統(tǒng)——畢赤酵母表達系統(tǒng)來實現(xiàn)RANTES蛋白的分泌表達。
本研究首先利用NCBI上登錄的RANTES基因序列(登錄號為NM002985)為依據(jù),設(shè)計引物,從人體血液中提取RNA,經(jīng)過RT-PCR和PCR擴增出相應(yīng)的RANTES基因片段。(兩端加入EcoR I和Not I酶切位點),轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,用菌落PCR和質(zhì)粒PCR方
4、法篩選陽性克??;用EcoR I和Not I酶切鑒定重組質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒用EcoR I和Not I酶切,切膠回收后定向插入pPIC9K質(zhì)粒,重組質(zhì)粒命名為pPIC9K/rantes。質(zhì)粒用Sal I酶切線性化處理后,經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母,對在MDS平板上生長出的單菌落進行G418抗生素篩選,以獲得高拷貝的陽性克隆,同時用MD和MM培養(yǎng)基,進行重組子的Mut+和Muts表型鑒定;破碎細胞,提取基因組,用PCR的方法進一步鑒定對獲取的
5、陽性克隆進行PCR驗證,選擇其中的Mut+型多拷貝陽性克隆進行甲醇誘導(dǎo)表達,并以整合上線性空載體的GS115作為對照。以甲醇誘導(dǎo)目的蛋白表達,產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Wesrtern-blot分析,得到高效表達RANTES的重組酵母,pPIC9K/rantes,SDS-PAGE和Western-blot分析證明誘導(dǎo)重組酵母表達了RANTES蛋白,分子量接近8KD,與預(yù)期的8~10KD的人體RANTES基因編碼蛋白質(zhì)構(gòu)成的融合蛋白大小一致
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