重組人干細胞因子(rhSCF)在畢赤酵母中的表達與鑒定.pdf

1、干細胞因子(stem cell factor，SCF)是一種對造血細胞有重要作用的細胞因子，主要作用于早期多能干細胞或原始造血祖細胞，促進這些細胞的存活、增殖和分化，具有重要的應用前景。當前，美國安進公司的rhSCF已在臨床上應用，同時多個臨床應用方向的研究也正在進行中。國內多家單位的研究已進行到臨床階段，但是以上rhSCF的生產都是建立在原核表達系統(tǒng)上的。為了發(fā)展在真核表達系統(tǒng)的rhSCF生物制劑，推進它的臨床應用，本文設計了rhSC

2、F的酵母表達系統(tǒng)、實現(xiàn)了高效表達、純化得到高活性的rhSCF，并對其進行鑒定。
　　 為了實現(xiàn)rhSCF在畢赤酵母中的高效表達，通過設計酵母菌喜好密碼子的cDNA，并采用PCR技術對分別合成的寡核苷酸片段進行拼接，合成全長rhSCF的cDNA。在cDNA轉入表達宿主菌前，將目標基因克隆入p-GEMT載體并進行DNA測序，構建重組pAO815SM1/rhSCF表達載體，通過原生質體法轉化酵母細胞，并進行了G418耐受試驗和誘導表達

3、的大規(guī)模篩選。
　　 為了實現(xiàn)建立高效的發(fā)酵、純化生產工藝，本文進行了工程菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化和30L發(fā)酵罐進行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)試驗，目的蛋白通過陽離子交換色譜柱進行捕獲、初步純化，分子排阻色譜柱精細純化和原液制備。
　　 為了驗證和控制產品的質量，本文采用HPLC法、質譜法、毛細管電泳法、N端測序、紫外掃描和MTT法等技術對產品的純度、分子量、等電點、胰酶肽圖、N端序列、紫外光譜特性和細胞學生物活性進行了鑒定。應用HPLC、

4、質譜等技術對rhSCF分子的包括氨基酸序列、二硫鍵、糖基化位點和糖鏈進行一級結構解析，判斷產品的結構信息是否與預期的一致。
　　 實驗結果表明，本文合成的cDNA序列與目標基因完全一致，重組pAO815SM1/rhSCF表達載體含有目標基因；轉化入畢赤酵母菌后，通過G418壓力篩選和誘導表達篩選獲得高拷貝的高表達菌株，表達量約50mg/L;通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，大規(guī)模發(fā)酵的rhSCF表達水平達100mg/L;HPLC-SEC法檢測目

5、標蛋白的純度為99.7％，電泳法顯示目標蛋白為糖基化和未糖基化的混合體，目標蛋白含量大于99%;質譜法得到蛋白分子量主帶分布在18-22KD之間，電泳法顯示蛋白的分子量分別約為18KD（未糖基化）和21KD（糖基化）：產品的等電點為5.38和5.26，其中等電點為5.38樣品約占81.7％；建立起了胰酶肽圖的分析方法：N端測序與理論序列相一致；紫外掃描特性符合蛋白質的特性；rhSCF原液比活性為1×106IU/mg;結構解析顯示蛋白的氨