釀酒酵母幾丁質(zhì)酶在畢赤酵母中的克隆表達和活性鑒定.pdf

1、釀酒酵母幾丁質(zhì)酶(CTSl．2)是一種來自釀酒酵母的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，它的酶切位點位于其同聚物內(nèi)的p．1，4連接的糖苷鍵，酶蛋白分子結(jié)構(gòu)從N端到C端依次為信號肽、幾丁質(zhì)催化區(qū)、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)以及一個短的C末端區(qū)Ⅲ。文獻中報道它對于幾丁質(zhì)有降解作用，并且對于真菌可能有一定的抑制作用。而甲殼質(zhì)廣泛存在于甲殼綱動物、軟體動物、昆蟲、真菌、高等植物以及海藻、動物關(guān)節(jié)、蹄、足等處，自然界每年生成的甲殼質(zhì)數(shù)量極其龐大，約有100億噸之巨，它是地球上除纖維

2、素之外數(shù)量最多的有機化合物。同時，對于動物、農(nóng)作物及水產(chǎn)養(yǎng)殖的真菌感染也是當(dāng)前有待解決的問題。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有很多研究機構(gòu)在對幾丁質(zhì)酶進行研究，主要也是集中在以上兩個方面。雖然取得了一定成果，但都還沒有形成產(chǎn)業(yè)化。本項研究采用畢赤酵母分泌表達系統(tǒng)作為表達生產(chǎn)工具，通過構(gòu)建相關(guān)表達載體及工程菌株，實現(xiàn)釀酒酵母幾丁質(zhì)酶在發(fā)酵液上清中實現(xiàn)高表達，并對釀酒酵母幾丁質(zhì)酶進行了相關(guān)的生物活性鑒定，同時對于釀酒酵母幾丁質(zhì)酶純化條件進行了初步摸索，為

3、下一步的研究工作奠定基礎(chǔ)。 本研究從釀酒酵母基因組中擴增出釀酒酵母幾丁質(zhì)酶基因，構(gòu)建了多種pPIC9-CTSl-2、pPIC9K-CTSl-2、pPICZa-CTSl-2單拷貝、多拷貝等重組表達載體，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、篩選，篩選出在GS¨5中高表達的工程菌株，使之在巴斯德畢赤酵母工程菌表達系統(tǒng)中獲得高表達，在搖瓶表達試驗中顯示目的蛋白的表達量可達到297．4mg／L。并對釀酒酵母幾丁質(zhì)酶進行了酶活性鑒定，幾丁質(zhì)降解實驗，抑菌實驗。同時對