白地霉脂肪酶在釀酒酵母和畢赤酵母細(xì)胞表面的展示研究.pdf

1、微生物脂肪酶具有底物選擇性廣、反應(yīng)條件溫和、在有機(jī)反應(yīng)體系中穩(wěn)定性好、副反應(yīng)和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn),是目前市場上應(yīng)用最廣泛的生物催化劑之一。但游離脂肪酶成本高、難以回收利用,而用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行固定化的脂肪酶純化操作復(fù)雜、回收較困難,這些缺點(diǎn)均限制了脂肪酶在工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用。為解決這些問題,本文以白地霉脂肪酶為研究對象,選擇釀酒酵母細(xì)胞壁蛋白 a凝集素為錨定蛋白,分別采用釀酒酵母和畢赤酵母兩種真核表面展示系統(tǒng)對其進(jìn)行表面展示,得到了穩(wěn)定性提高

2、、生產(chǎn)成本相對低廉的白地霉脂肪酶全細(xì)胞催化劑。在此基礎(chǔ)上,研究了酵母表面展示白地霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì),并篩選優(yōu)良的全細(xì)胞催化劑用于催化魚油水解富集DHA和EPA,為其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本文的主要研究工作和創(chuàng)新點(diǎn)如下:
　　(1)首次以N-末端錨定在釀酒酵母細(xì)胞壁上的a凝集素為錨定蛋白,將白地霉脂肪酶GCL展示在釀酒酵母EBY100細(xì)胞表面。表面展示的GCL對水解pNPC的酶活力為43.7±0.5U/g干細(xì)胞,但無法水解橄欖油

3、,推測其可能原因是展示效率不高或釀酒酵母的過糖基化修飾造成酶蛋白的活性中心被遮蔽。釀酒酵母表面展示GCL的最適反應(yīng)溫度和pH分別為40℃和8.5,熱穩(wěn)定性較游離酶有較大的提高,在40℃水浴中溫浴3 h后殘余活力為85％。
　　(2)以釀酒酵母細(xì)胞壁蛋白a凝集素為錨定蛋白,成功構(gòu)建了新的畢赤酵母表面展示載體pPICZXFa。將白地霉脂肪酶基因克隆到該載體中得到pPICZXFa-△GCL,用BstX I線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中

4、,得到重組菌株X-33/pPICZXFa-△GCL。通過搖瓶發(fā)酵篩選到一株展示酶活力最高的5＃重組子,并對其發(fā)酵培養(yǎng)基和條件進(jìn)行了優(yōu)化。在甲醇添加量為1％(v/v),接種量為4％(v/v),初始pH7.0的條件下,表面展示的GCL不僅能水解橄欖油且其酶活力由最初的180.2±4.45U/g干細(xì)胞提高到273±2.4U/g干細(xì)胞。
　　(3)分別以pNPC和橄欖油為底物,考察了畢赤酵母表面展示的GCL水解對硝基苯酚酯和甘油三酯的最適

5、反應(yīng)溫度和pH、熱穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì),評價其應(yīng)用價值。以pNPC為底物時,其最適反應(yīng)溫度和pH分別為40℃和9.0,在40℃水浴中溫浴6 h后,殘余酶活力為80％;以橄欖油為底物時,其最適反應(yīng)溫度和pH分別為45℃和7.5,在45℃水浴中溫浴4h后,殘余酶活力為80％。
　　(4)首次利用固定化在畢赤酵母細(xì)胞表面的GCL催化魚油水解,探索其作為全細(xì)胞催化劑富集DHA和EPA的工業(yè)應(yīng)用潛能。結(jié)果表明:其催化水解魚油反應(yīng)14h后,水解度