具有協(xié)同效應(yīng)的南極假絲酵母脂肪酶B和疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶在畢赤酵母中的共展示研究.pdf

1、表面展示技術(shù)是將外源蛋白以融合蛋白的形式展示在微生物表面并保持其原有生物活性的技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于全細(xì)胞催化劑、抗體制備、生物傳感器和疫苗等領(lǐng)域。南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)和疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)具有獨(dú)特的脂肪酶催化特性,本研究采用表面展示技術(shù)將這兩種脂肪酶共展示在畢赤酵母細(xì)胞表面作為全細(xì)胞催化劑,酶活力

2、及催化效率均得到較大提高,具有重要意義。目前尚無具有協(xié)同效應(yīng)脂肪酶在畢赤酵母細(xì)胞表面共展示的報(bào)道。
　　本研究依據(jù)生物信息學(xué)軟件VMD6.0對(duì)脂肪酶晶體結(jié)構(gòu)可視化分析結(jié)果,首先分別選擇幾種合適的錨定蛋白與 EGFP和RFP融合,構(gòu)建基于畢赤酵母pPIC9k和pPICZαA的展示系統(tǒng),并評(píng)價(jià)錨定蛋白對(duì)熒光蛋白EGFP和RFP的展示效果。然后,分別選擇適合于兩種表達(dá)系統(tǒng)的錨定蛋白,構(gòu)建畢赤酵母CALB單展示系統(tǒng)和TLL單展示系統(tǒng)。在此

3、基礎(chǔ)上,采用二次電轉(zhuǎn)的方法將CALB和TLL共展示在畢赤酵母細(xì)胞表面。本論文主要研究工作及結(jié)果摘要如下:
　　1.以加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為靶蛋白,以Cwp2p、Sed1p、α凝集素為C端錨定蛋白,分別構(gòu)建基于畢赤酵母pPIC9k表達(dá)系統(tǒng),經(jīng)篩選各獲得1株重組菌。對(duì)重組菌發(fā)酵細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果表明:Cwp2p對(duì)EGFP展示率為53.35％;Sed1p對(duì)EGFP展示率為99.5％;α凝集素對(duì)EGFP的展示率為46.

4、26％。以Sed1p為錨定蛋白,成功構(gòu)建CALB單展示系統(tǒng),最終獲得1株橄欖油水解酶活為85.5U/g干細(xì)胞的CALB單展示重組子?？贵w處理后的重組子發(fā)酵細(xì)胞經(jīng)免疫熒光檢測(cè),結(jié)果表明,熒光顯微鏡下酵母細(xì)胞表面呈現(xiàn)明顯的綠色熒光,流式細(xì)胞儀分析其展示率達(dá)98.81％。單展示CALB全細(xì)胞催化劑酶學(xué)性質(zhì)如下:最適溫度為40℃,pH為8.5,在40℃和60℃條件下1h內(nèi)分別保持85％和30％酶活力,K2+、Ca2+、Mg2+對(duì)該酶有微弱激活作

5、用,Mn2+、Cu2+、EDTA、DMSO、TritonX100、甲醇等對(duì)其活力有抑制作用,SDS對(duì)活力影響不大。
　　2.以紅色熒光蛋白(RFP)為靶蛋白,以N端部分缺失的Flo1p和Sed1p為錨定蛋白,構(gòu)建基于pPICZαA的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。將篩選獲得的1株展示RFP的重組菌進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果表明:Flo1p對(duì)RFP展示率為24.66％,Sed1p對(duì)RFP展示率為98.36％。以Sed1p為錨定蛋白,成功構(gòu)建TLL單

6、展示系統(tǒng),最終獲得1株橄欖油水解酶活達(dá)257.8 U/g干細(xì)胞的展示TLL重組子。免疫熒光檢測(cè)表明,其發(fā)酵細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的紅色熒光,流式細(xì)胞儀分析其展示率達(dá)98.02％。單展示TLL酶學(xué)性質(zhì)如下:其最適底物碳鏈長度為C4;最適溫度為30℃;最適pH為8.0;K2+、Ca2+、Mg2+對(duì)展示的TLL存在微弱的激活作用;Mn2+、Ni2+對(duì)其有微弱的抑制作用;Cu2+、甲醇、乙醇、異丙醇等對(duì)其抑制作用較強(qiáng),具備良好的熱穩(wěn)定性和有

7、機(jī)溶劑穩(wěn)定性。
　　3.將表達(dá)載體pPICZαA-TLS電轉(zhuǎn)化重組菌GS115/pPIC9k-CAS,篩選獲得1株橄欖油水解酶活為623U/g干細(xì)胞的CALB和TLL共展示重組子,其活力分別比單展示CALB和單展示TLL提高了7.3倍和2.4倍。共展示重組子發(fā)酵細(xì)胞經(jīng)抗體處理后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),結(jié)果如下:在熒光顯微鏡下,采用488nm和545nm激發(fā)光分別觀察到重組酵母細(xì)胞表面呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光和紅色熒光,流式細(xì)胞儀分析其CALB

8、和TLL的展示率分別為94.86％和74.45％。共展示重組子酶學(xué)性質(zhì)如下:最適碳鏈長度為C4;最適溫度為30℃;最適pH為8.5;K2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、EDTA、DMSO、TritonX-100、SDS對(duì)共展示細(xì)胞存在微弱的激活作用;Ni2+對(duì)其有微弱的抑制作用;Cu2+、甲醇、乙醇、異丙醇等對(duì)其抑制作用較強(qiáng),具備良好的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性。共展示CALB和TLL重組細(xì)胞催化生物柴油得率為72.62％,比單獨(dú)展示C