南極假絲酵母脂肪酶B高效表達(dá)及在選擇性?；矫娴膽?yīng)用研究.pdf

1、南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctic lipase B， CALB）來源于南極假絲酵母，是一種優(yōu)良的脂肪酶，它對(duì)水溶性、非水溶性物質(zhì)都有很強(qiáng)的催化活性，在有機(jī)合成、手性化合物拆分、醫(yī)藥中間體等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而南極假絲酵母產(chǎn)酶量低，發(fā)酵周期長，遠(yuǎn)不能滿足目前的需求。而通過基因改良的米曲霉發(fā)酵獲得的CALB，其售價(jià)約為16000元/千克，不適合工業(yè)化應(yīng)用。
　　 本課題主要目的是以畢赤酵母（Pichia p

2、astoris）作為表達(dá)系統(tǒng)，通過基因工程手段提高CALB的表達(dá)量，從而降低其工業(yè)應(yīng)用的成本。主要研究內(nèi)容及其結(jié)果如下：
　　 首先，探索野生型CALB基因在畢赤酵母表達(dá)的可行性。以南極假絲酵母基因組為模板擴(kuò)增CALB基因的前導(dǎo)肽（pro-peptide）和編碼成熟肽(mat-peptide)部分，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入pPIC9K的多克隆位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-CALB，將其線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，最終獲得8拷貝

3、數(shù)的重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-CALB。對(duì)GS115-pPIC9K-CALB進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，收集不同誘導(dǎo)時(shí)間的上清液進(jìn)行酶活測(cè)定和SDS-PAGE分析，結(jié)果表明畢赤酵母無法表達(dá)野生型CALB。
　　 其次，鑒于野生型CALB基因無法在畢赤酵母系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)表達(dá)，根據(jù)CALB的氨基酸序列（GenBank accession No. Z30645.1），采用巴斯德畢赤酵母偏好密碼子重新設(shè)計(jì)CALB基因序列，序列保留pro-pep

4、tide和mat-peptide部分，并在序列的下游添加His-Tag標(biāo)簽序列，合成優(yōu)化序列。將序列插入pPIC9K的多克隆位點(diǎn)得到重組質(zhì)粒pPIC9K-syCALB，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后得到重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-syCALB。經(jīng)過1％甲醇誘導(dǎo)120h，酶活力達(dá)到最大值46U mL-1，蛋白表達(dá)量為242.2mg L-1。SDS-PAGE分析表明重組CALB分子量為35kd和38kd，比野生型CALB略大。通過金屬螯

5、合層析對(duì)發(fā)酵上清液純化，將目的蛋白純化了5.23倍，比活達(dá)到856.7U mg-1，酶活的回收率達(dá)到81.2%。對(duì)重組CALB進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，其最適反應(yīng)溫度和pH分別為30℃和6.5，CALB在pH為5.0-8.0之間、40℃以下有較好穩(wěn)定性，Ca2+，2n2+，Mn2+有助于酶活的提高，而Cu2+，Ag+，F(xiàn)e3+強(qiáng)烈抑制酶催化反應(yīng)。搖瓶優(yōu)化階段，確定最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY，培養(yǎng)基最適pH為6.0，最佳誘導(dǎo)溫度為20℃，甲醇最

6、適添加量為2%。使用3.6L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-syCALB，采用變溫發(fā)酵策略，以BSM作為培養(yǎng)基。前期流加甘油充當(dāng)碳源，30℃培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞干重為25.7g L-1時(shí)進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為20℃，甲醇起始流加速率為1.8mLh-1 L-1，根據(jù)溶氧變化手動(dòng)控制甲醇流加速率，維持溶氧值為25%。誘導(dǎo)112h后酶活為163.7U mL-1，蛋白濃度在誘導(dǎo)124h達(dá)到最大值，為824.7mg L-1。

7、>　　 最后，在畢赤酵母高效表達(dá)CALB的基礎(chǔ)上，嘗試以聚丙烯樹脂(PP)固定化CALB，并以PP-CALB催化維生素A前體的單酰化反應(yīng)。以商品化CALB，即Novozyme435優(yōu)化得到最佳反應(yīng)條件：溶劑為正己烷（分子篩干燥除水），?；w為乙酸乙烯酯，其與維生素A前體的摩爾比控制在3∶1，酶添加量為5mg mL-1，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間90min。Novozyme435和PP-CALB對(duì)氫化物轉(zhuǎn)化率分別為88.7%和39%，產(chǎn)