酶活性中心穩(wěn)定化策略提高褶皺假絲酵母脂肪酶的穩(wěn)定性.pdf

1、酶穩(wěn)定化機(jī)制是生物學(xué)家密切關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題。以酶結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)來(lái)探索酶穩(wěn)定性與催化效率/底物選擇性復(fù)雜作用機(jī)制，不僅能揭示酶蛋白的自然進(jìn)化規(guī)律，同時(shí)也將為酶生物催化劑的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度研究表明，酶蛋白中每個(gè)組成氨基酸原子的電子密度在平衡位點(diǎn)存在著空間“模糊度”，即B-factor。近年來(lái)，科學(xué)家們對(duì)高B-factor殘基替換來(lái)提高酶穩(wěn)定性的研究高度關(guān)注，但目前仍缺少通用的指導(dǎo)原則，尤其是對(duì)分子量較高、結(jié)構(gòu)復(fù)

2、雜蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化已成為挑戰(zhàn)。我們課題組從酶最關(guān)鍵部位-活性中心入手，選擇高B-factor殘基進(jìn)行突變，促使南極徦絲酵母脂肪酶B（CalB，317個(gè)殘基）的穩(wěn)定性明顯提高，并揭示了酶活性中心穩(wěn)定化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。為更深入和全面地探討酶活性中心穩(wěn)定化（Active site stabilization，ACS）機(jī)制，本研究選擇具有更高結(jié)構(gòu)復(fù)雜度的褶皺假絲酵母脂肪酶1（LIP1，534個(gè)殘基）為研究對(duì)象，系統(tǒng)地研究了活性中心高B-factor殘

3、基對(duì)酶穩(wěn)定性、催化活性及底物選擇性等功能的影響，并通過(guò)對(duì)相關(guān)酶比較分析，探索了這些殘基柔性、空間分布等因素對(duì)酶穩(wěn)定性的重要影響。
　　首先，我們對(duì) LIP1進(jìn)行了克隆表達(dá)、純化及性質(zhì)表征。將裝載于穿梭質(zhì)粒pGAPZαA上的LIP1基因在畢赤酵母中進(jìn)行了高效表達(dá)；純化的重組酶對(duì)中長(zhǎng)鏈的對(duì)硝基苯酚酯和甘油三酯底物有較高的水解活力；最適溫度為45℃，最適pH為8.0；60℃的半衰期僅為6 min，穩(wěn)定性較差，進(jìn)一步突變將有利于改善其酶學(xué)

4、性質(zhì)。為快速構(gòu)建酶突變庫(kù)，我們建立了一種基于兩步PCR的真核細(xì)胞突變庫(kù)構(gòu)建新方法，避免了大腸桿菌和限制性內(nèi)切酶的使用，使建庫(kù)周期由原來(lái)一周時(shí)間縮短為一天，轉(zhuǎn)化率達(dá)到6.9×103/μ g。
　　我們對(duì)LIP1活性中心附近的殘基進(jìn)行B-factor值分析，選取了催化殘基Ser209周圍10?以內(nèi)的18個(gè)高柔性殘基進(jìn)行了飽和突變，并從以下兩方面探討其酶學(xué)功能的變化機(jī)制。
　　1)酶穩(wěn)定性與底物選擇性相關(guān)性研究
　　LIP1

5、與其同工酶的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Gly414殘基與其它同工酶均不同（Ala/Thr）。該位點(diǎn)位于兩個(gè)螺旋的轉(zhuǎn)角，屬于酶分子中柔性較高的區(qū)域；因其在底物通道上，對(duì)它的突變可能會(huì)對(duì)底物的結(jié)合產(chǎn)生重要影響。我們對(duì)Gly414進(jìn)行飽和突變，從200多個(gè)單菌落中篩選獲得了4個(gè)穩(wěn)定性提高的突變體（G414A、G414M、G414H和G414W）。相對(duì)于野生型的最適反應(yīng)溫度（45℃），突變體分別提高到50℃、55℃、58℃和60℃。最穩(wěn)定突變體G414W的

6、最適底物由原來(lái)pNP-C8轉(zhuǎn)變?yōu)閜NP-C4。分子對(duì)接和模擬分析顯示活性中心中有多個(gè)疏水相互作用和氫鍵形成，這可能是導(dǎo)致其穩(wěn)定性提高的原因；色氨酸具有β-吲哚基側(cè)鏈對(duì)長(zhǎng)鏈底物的進(jìn)入形成了較大的空間位阻，從而導(dǎo)致酶的底物偏好性向短鏈?；D(zhuǎn)移。
　　2)酶穩(wěn)定性與催化活性相關(guān)性的系統(tǒng)研究
　　我們進(jìn)一步又對(duì)LIP1活性中心18個(gè)高B-factor殘基進(jìn)行了飽和突變，探索酶穩(wěn)定性與催化活性的相關(guān)性。借助平板與兩步96孔板結(jié)合的三級(jí)

7、篩選方法，在保持突變酶活性及穩(wěn)定性高于野生型酶的雙重篩選條件下，從2.0×104多個(gè)單菌落中獲得了5個(gè)穩(wěn)定性和活性都有明顯改善的突變體（F344M、F334I、F434Y、F133Y和F121Y）。通過(guò)有序疊加組合突變方案，即用穩(wěn)定性提高幅度最大與次大的逐級(jí)疊加，快速獲得了穩(wěn)定性提高最顯著的突變體 Var3（F344I/F434Y/F133Y/F121Y），60℃的半衰期提升了近40倍，活力與野生型相當(dāng)。疊加突變過(guò)程中，也獲得催化效率比

8、野生型高2.2倍的突變體Var1（F344I/F434Y），同時(shí)半衰期也提高了近10倍。對(duì)突變體模型結(jié)構(gòu)的分析表明氫鍵網(wǎng)絡(luò)的形成和緊密的堆疊是提高穩(wěn)定性的主要原因。
　　為深入認(rèn)識(shí)酶活性中心穩(wěn)定化現(xiàn)象，我們對(duì)具有不同結(jié)構(gòu)復(fù)雜度脂肪酶的熱穩(wěn)定突變結(jié)果進(jìn)行了比較分析，探討了B-factor相對(duì)值、突變位點(diǎn)與催化中心的距離對(duì)酶穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)距離催化殘基6~10?附近的高B-factor殘基（B-factor相對(duì)值在60~100）為突