酶活性中心穩(wěn)定化策略提高褶皺假絲酵母脂肪酶的穩(wěn)定性.pdf

1、酶穩(wěn)定化機制是生物學(xué)家密切關(guān)注的科學(xué)問題。以酶結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)來探索酶穩(wěn)定性與催化效率/底物選擇性復(fù)雜作用機制，不僅能揭示酶蛋白的自然進化規(guī)律，同時也將為酶生物催化劑的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度研究表明，酶蛋白中每個組成氨基酸原子的電子密度在平衡位點存在著空間“模糊度”，即B-factor。近年來，科學(xué)家們對高B-factor殘基替換來提高酶穩(wěn)定性的研究高度關(guān)注，但目前仍缺少通用的指導(dǎo)原則，尤其是對分子量較高、結(jié)構(gòu)復(fù)

2、雜蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化已成為挑戰(zhàn)。我們課題組從酶最關(guān)鍵部位-活性中心入手，選擇高B-factor殘基進行突變，促使南極徦絲酵母脂肪酶B（CalB，317個殘基）的穩(wěn)定性明顯提高，并揭示了酶活性中心穩(wěn)定化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。為更深入和全面地探討酶活性中心穩(wěn)定化（Active site stabilization，ACS）機制，本研究選擇具有更高結(jié)構(gòu)復(fù)雜度的褶皺假絲酵母脂肪酶1（LIP1，534個殘基）為研究對象，系統(tǒng)地研究了活性中心高B-factor殘

3、基對酶穩(wěn)定性、催化活性及底物選擇性等功能的影響，并通過對相關(guān)酶比較分析，探索了這些殘基柔性、空間分布等因素對酶穩(wěn)定性的重要影響。
　　首先，我們對 LIP1進行了克隆表達、純化及性質(zhì)表征。將裝載于穿梭質(zhì)粒pGAPZαA上的LIP1基因在畢赤酵母中進行了高效表達；純化的重組酶對中長鏈的對硝基苯酚酯和甘油三酯底物有較高的水解活力；最適溫度為45℃，最適pH為8.0；60℃的半衰期僅為6 min，穩(wěn)定性較差，進一步突變將有利于改善其酶學(xué)

4、性質(zhì)。為快速構(gòu)建酶突變庫，我們建立了一種基于兩步PCR的真核細胞突變庫構(gòu)建新方法，避免了大腸桿菌和限制性內(nèi)切酶的使用，使建庫周期由原來一周時間縮短為一天，轉(zhuǎn)化率達到6.9×103/μ g。
　　我們對LIP1活性中心附近的殘基進行B-factor值分析，選取了催化殘基Ser209周圍10?以內(nèi)的18個高柔性殘基進行了飽和突變，并從以下兩方面探討其酶學(xué)功能的變化機制。
　　1)酶穩(wěn)定性與底物選擇性相關(guān)性研究
　　LIP1

5、與其同工酶的序列比對發(fā)現(xiàn)，Gly414殘基與其它同工酶均不同（Ala/Thr）。該位點位于兩個螺旋的轉(zhuǎn)角，屬于酶分子中柔性較高的區(qū)域；因其在底物通道上，對它的突變可能會對底物的結(jié)合產(chǎn)生重要影響。我們對Gly414進行飽和突變，從200多個單菌落中篩選獲得了4個穩(wěn)定性提高的突變體（G414A、G414M、G414H和G414W）。相對于野生型的最適反應(yīng)溫度（45℃），突變體分別提高到50℃、55℃、58℃和60℃。最穩(wěn)定突變體G414W的

6、最適底物由原來pNP-C8轉(zhuǎn)變?yōu)閜NP-C4。分子對接和模擬分析顯示活性中心中有多個疏水相互作用和氫鍵形成，這可能是導(dǎo)致其穩(wěn)定性提高的原因；色氨酸具有β-吲哚基側(cè)鏈對長鏈底物的進入形成了較大的空間位阻，從而導(dǎo)致酶的底物偏好性向短鏈?；D(zhuǎn)移。
　　2)酶穩(wěn)定性與催化活性相關(guān)性的系統(tǒng)研究
　　我們進一步又對LIP1活性中心18個高B-factor殘基進行了飽和突變，探索酶穩(wěn)定性與催化活性的相關(guān)性。借助平板與兩步96孔板結(jié)合的三級

7、篩選方法，在保持突變酶活性及穩(wěn)定性高于野生型酶的雙重篩選條件下，從2.0×104多個單菌落中獲得了5個穩(wěn)定性和活性都有明顯改善的突變體（F344M、F334I、F434Y、F133Y和F121Y）。通過有序疊加組合突變方案，即用穩(wěn)定性提高幅度最大與次大的逐級疊加，快速獲得了穩(wěn)定性提高最顯著的突變體 Var3（F344I/F434Y/F133Y/F121Y），60℃的半衰期提升了近40倍，活力與野生型相當(dāng)。疊加突變過程中，也獲得催化效率比

8、野生型高2.2倍的突變體Var1（F344I/F434Y），同時半衰期也提高了近10倍。對突變體模型結(jié)構(gòu)的分析表明氫鍵網(wǎng)絡(luò)的形成和緊密的堆疊是提高穩(wěn)定性的主要原因。
　　為深入認識酶活性中心穩(wěn)定化現(xiàn)象，我們對具有不同結(jié)構(gòu)復(fù)雜度脂肪酶的熱穩(wěn)定突變結(jié)果進行了比較分析，探討了B-factor相對值、突變位點與催化中心的距離對酶穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)距離催化殘基6~10?附近的高B-factor殘基（B-factor相對值在60~100）為突