谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在脂肪酶穩(wěn)定性改善中的應(yīng)用.pdf

1、脂肪酶是工業(yè)應(yīng)用中最為廣泛的酶制劑之一，可應(yīng)用于食品、洗滌劑、制藥、皮革、紡織、化妝品、造紙工業(yè)和生物柴油等領(lǐng)域。天然的脂肪酶穩(wěn)定性一般較差，而工業(yè)應(yīng)用上在生產(chǎn)、運(yùn)輸、存儲(chǔ)工程中對(duì)于酶的活性和穩(wěn)定性都有一定的要求。因此需要對(duì)酶進(jìn)行改造修飾從而提高酶的活性和穩(wěn)定性。
　　在近些年的研究中，脂肪酶改性的方法主要有蛋白質(zhì)工程（包括定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)）、脂肪酶的固定化（吸附法、共價(jià)結(jié)合法、包埋法）。這些方法都能夠一定程度上有效的改善脂肪酶

2、的性能。但是蛋白質(zhì)工程耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，而固定化需要考慮載體的選擇和成本問(wèn)題，因此我們希望通過(guò)一種簡(jiǎn)單有效的方法對(duì)脂肪酶進(jìn)行改性修飾來(lái)達(dá)到我們預(yù)期的目的。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TGase)是食品蛋白加工中常用的一種交聯(lián)劑。它可以催化蛋白質(zhì)或多肽的谷氨酸(Glu)的γ-羧酰胺殘基和賴(lài)氨酸(Lys)的ε-氨基發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，生成異肽鍵（ε-（γ-谷氨酰胺）-賴(lài)氨酸），從而使蛋白質(zhì)分子之間或之內(nèi)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在食品加工中可以有效的改

3、善食品蛋白的穩(wěn)定性、溶解性、保水性等性質(zhì)。而酶分子也是一種蛋白質(zhì)，因此本論文將谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶應(yīng)用于脂肪酶的改性修飾過(guò)程。
　　與戊二醛等傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)劑相比，TGase安全、無(wú)毒且生物相容性好。研究過(guò)程中對(duì)TGase催化制備交聯(lián)酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)交聯(lián)體系中的保護(hù)蛋白進(jìn)行了篩選，最后得出最優(yōu)的反應(yīng)條件為T(mén)Gase添加量為120U/g lip，反應(yīng)體系pH7(離子強(qiáng)度100mM)，25℃，180rpm，反應(yīng)24h，最適保護(hù)蛋白為明膠

4、，添加量為脂肪酶∶明膠=2∶1。通過(guò)脂肪酶的熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)，TGase催化制備的交聯(lián)脂肪酶在50℃，1h條件下酶活基本沒(méi)有損失，而游離脂肪酶在1h后，酶活保留率僅在20％左右，說(shuō)明采用這種方式交聯(lián)后可以有效改善酶的熱穩(wěn)定性。此外我們還選取了不同來(lái)源的脂肪酶（如lipase Mfrom Mucor Javanicus、lipase Gfrom Penicillium Camemberti、lipase Afrom Aspergillus ni

5、ger、lipase from porcine pancreas等）利用此方法進(jìn)行了改性修飾，證明了此方法具有一定的普適性。通過(guò)不伺的分析手段如電鏡、熒光光譜、圓二色譜對(duì)交聯(lián)脂肪酶進(jìn)行了分析表征，通過(guò)電鏡分析交聯(lián)酶分子的尺寸變大，熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)交聯(lián)酶在400nm左右出現(xiàn)新的發(fā)射峰，圓二色譜分析交聯(lián)酶的α-Helix解構(gòu)有所減少。除了提高了脂肪酶的活性和穩(wěn)定性，我們還發(fā)現(xiàn)脂肪酶的過(guò)氧化氫耐受性有了一定的提高，因此我們將交聯(lián)脂肪酶應(yīng)用于油