谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分離純化及其在豆腐生產(chǎn)加工中的應(yīng)用.pdf

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase，TGase)是一種能催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，可催化蛋白質(zhì)在分子內(nèi)和分子間發(fā)生共價交聯(lián)，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)如:發(fā)泡性，乳化性，乳化穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性、保水性和凝膠能力等，進(jìn)而改善食品的風(fēng)味、口感、質(zhì)地和外觀，因此其在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景。
　　豆腐是最常見的豆制品，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和微量元素。其因凝固劑的不同主要分為三類:一是以鹽鹵為凝固劑，多見于北方

2、地區(qū)，稱為北豆腐，含水量在85％～88％，較硬;二是以石膏粉為凝固劑，多見于南方，稱為南豆腐，含水量較北豆腐多，可達(dá)90％;三是以葡萄糖酸內(nèi)酯為凝固劑，稱為內(nèi)酯豆腐。與其他傳統(tǒng)豆腐制作工藝相比，內(nèi)酯豆腐有較高的出品率和產(chǎn)品質(zhì)量，較少的環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，但也有強(qiáng)度不足、缺少豆香味的缺點(diǎn)。本試驗在內(nèi)酯豆腐制作工藝的基礎(chǔ)上，探索TGase與葡萄糖酸內(nèi)酯共同作用對豆腐品質(zhì)的影響，以建立豆腐生產(chǎn)新工藝，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，滿足消費(fèi)者需求。
　

3、　本試驗通過對市場常見五種TGase酶制劑產(chǎn)品酶活性的檢測，選擇質(zhì)量最佳的酶制劑產(chǎn)品進(jìn)行TGase的分離純化、研究其酶學(xué)性質(zhì)并對其在豆腐生產(chǎn)加工中的應(yīng)用進(jìn)行了探討。主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)將市場上常見的TGase酶制劑等量稀釋后進(jìn)行了酶活性和酶的比活力檢測，通過酶活性確定酶產(chǎn)品的質(zhì)量，其中質(zhì)量最佳的樣品酶制劑為產(chǎn)品“D”，其酶活性濃度為0.466U/mL，比活力為29.36U/mg。
　　(2)以產(chǎn)品“D”為研究材料，

4、通過分子篩法和離子交換層析法對其TGase進(jìn)行了分離純化。Native-PAGE和SDS-PAGE電泳結(jié)果證明具有TGase活性的目的蛋白分子量約為80kDa;產(chǎn)品“D”通過SephadexG-100分離純化后，具有TGase活性的蛋白組分酶活性濃度為0.592U/mL，蛋白濃度為9.22μg/mL，比活力64.21U/mg，與初始樣品比較，TGase被純化了2.119倍;回收蛋白組分經(jīng)DEAE-52陰離子交換層析分離純化后，TGase

5、組分的酶活性濃度為0.521U/mL，蛋白質(zhì)含量6.613μg/mL，比活力為78.78U/mg，TGase被純化了2.638倍;SDS-PAGE電泳確定純化后的TGase由分子量約為80kDa的兩條蛋白帶組成。
　　(3)研究了溫度、pH、有機(jī)溶劑、金屬離子、貯藏溫度對TGase活性的影響以及不同條件相互作用時各個因素對體系反應(yīng)進(jìn)程的影響。結(jié)果表明純化后的TGase最適反應(yīng)溫度為55℃，最適pH為6～7;K+、Ca2+、Na+、

6、Mg2+、Cl-離子對TGase活性均無影響，但Cu2+對TGase活性具有明顯抑制作用;乙醇對TGase活性有抑制作用，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40％時，對TGase活性抑制作用最強(qiáng)。TGase在-20℃～65℃下保存48小時后發(fā)現(xiàn)，55℃以下保存對酶活沒有明顯影響，60℃以上對酶活有抑制作用。在一定條件下，影響體系反應(yīng)速率的最主要因素為體系的pH，其次為體系內(nèi)乙醇的比例，第三為反應(yīng)時間，最后為反應(yīng)體系的溫度。
　　(4)研究了不同添加量

7、的TGase與葡萄糖酸內(nèi)酯組成的復(fù)合凝固劑對豆腐品質(zhì)的影響。將通過感觀評價和二次咀嚼測試確定最適宜的添加比例。利用感官評定的方法，分別評價了TGase含量2.5％、5％、7.5％;內(nèi)酯含量0.1％、0.2％，0.3％以及二者交叉組合添加的試驗成品，評價結(jié)果表明:TGase添加量為5％，葡萄糖酸內(nèi)酯添加量為0.2％最受歡迎。
　　(5)為進(jìn)一步優(yōu)化豆腐凝固劑配比，利用響應(yīng)面設(shè)計方法確定了豆腐的復(fù)合凝固劑中各成分的比例。以TGase(

8、A)、葡萄糖酸內(nèi)酯(B)點(diǎn)漿溫度(C)為自變量，分別以彈性(R1)、內(nèi)聚性(R2)為響應(yīng)值，通過Design Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸分析，確定出適宜的加工條件為:TGase添加量4.82％、內(nèi)酯添加量0.17％、點(diǎn)漿溫度為52.56℃，此時的彈性3.62772mm，得到如下回歸模型:R1=3.60-0.047A+0.011B+0.086C-0.073AB-0.027AC-0.085BC-0.15A2-0.12B2-

9、0.076C2結(jié)果表明:在此條件下進(jìn)行豆腐的制作，此時的彈性3.62772mm，彈性程度符合消費(fèi)者需求。若以內(nèi)聚性(R2)為響應(yīng)值，通過Design Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸分析，得到回歸模型:R2=0.27-1.25E-4A-2.00E-3B+2.625E-3C-1.5E-3AB-2.5E-4AC-1.500E-3BC-1.875E-3A2-2.625E-3B2-3.875E-3C2結(jié)果表明:此條件下，內(nèi)聚性為0.