疏棉狀嗜熱絲孢菌熱穩(wěn)定脂肪酶的基因克隆與表達.pdf_第1頁
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1、山東農業(yè)大學碩士學位論文疏棉狀嗜熱絲孢菌熱穩(wěn)定脂肪酶的基因克隆與表達姓名:鄭艷申請學位級別:碩士專業(yè):微生物學指導教師:李多川20080615山東農業(yè)大學碩士學位論文中文摘要脂肪酶(1ipase,EC3113),全稱三酰甘油酰基水解酶,廣泛存在于生物體內。它能夠催化油脂上甘油酯鍵的水解,也可催化酯交換、酯化、醇解和酸解等反應。微生物來源的脂肪酶由于作用多樣、易于培養(yǎng)、產量豐富等特點而被廣泛用于工業(yè)生產,其中熱穩(wěn)定脂肪酶的研究和開發(fā)更是具

2、有重要的商業(yè)價值。疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)是一種分布廣泛、生長上限溫度較高的真菌。它能夠產生熱穩(wěn)定的具有重要工業(yè)價值的脂肪酶,但是野生菌產酶存在培養(yǎng)溫度高等較多不利因素,因而近年來主要研究方向集中于采用基因工程方法構建重組菌,進而表達獲得脂肪酶。本研究中T1anuginosus在添加橄欖油的誘導培養(yǎng)基上產生了脂肪酶。根據(jù)已報道的脂肪酶同源保守序列,以及GenBank已注冊的T1anuginosus

3、脂肪酶序列(AF054513)設計特異引物,綜合運用PCR、RTPCR、TailPCR技術克隆到兩個脂肪酶基因的全長DNA和cDNA序列,將兩個基因分別命名為匆和砌。其中匆基因DNA序列長1071bp,有3內含子;cDNA序列長885bp,開放閱讀框編碼291個氨基酸,其中前17個氨基酸構成信號肽,序列提交GenBank,登錄號分別為EU022703和EU370914。/n基因DNA序列長1209bp,含有3個內含子;全長cDNA序列為

4、1095bp,包含一個編碼291個氨基酸的開放閱讀框,前17個氨基酸構成信號肽。序列在Genbank中注冊,登錄號為EU004197和EU004196。比對分析由核苷酸序列推導的相應氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)兩個脂肪酶均具有GHSLG,即霉菌脂肪酶保守序列。二者氨基酸同源性為7869%。將基因匆和揚分別與酵母分泌型表達載體pPIC9K雙酶切后體外連接,構建酵母重組表達載體pPIC9K//gy和pPIC9K/ln,并測序保證正確的閱讀框。將重組表達

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