疏棉狀嗜熱絲孢菌熱穩(wěn)定脂肪酶的基因克隆與表達.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文疏棉狀嗜熱絲孢菌熱穩(wěn)定脂肪酶的基因克隆與表達姓名：鄭艷申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物學指導教師：李多川20080615山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文中文摘要脂肪酶(1ipase，EC3113)，全稱三酰甘油?；饷?，廣泛存在于生物體內(nèi)。它能夠催化油脂上甘油酯鍵的水解，也可催化酯交換、酯化、醇解和酸解等反應。微生物來源的脂肪酶由于作用多樣、易于培養(yǎng)、產(chǎn)量豐富等特點而被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，其中熱穩(wěn)定脂肪酶的研究和開發(fā)更是具

2、有重要的商業(yè)價值。疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)是一種分布廣泛、生長上限溫度較高的真菌。它能夠產(chǎn)生熱穩(wěn)定的具有重要工業(yè)價值的脂肪酶，但是野生菌產(chǎn)酶存在培養(yǎng)溫度高等較多不利因素，因而近年來主要研究方向集中于采用基因工程方法構建重組菌，進而表達獲得脂肪酶。本研究中T1anuginosus在添加橄欖油的誘導培養(yǎng)基上產(chǎn)生了脂肪酶。根據(jù)已報道的脂肪酶同源保守序列，以及GenBank已注冊的T1anuginosus

3、脂肪酶序列(AF054513)設計特異引物，綜合運用PCR、RTPCR、TailPCR技術克隆到兩個脂肪酶基因的全長DNA和cDNA序列，將兩個基因分別命名為匆和砌。其中匆基因DNA序列長1071bp，有3內(nèi)含子；cDNA序列長885bp，開放閱讀框編碼291個氨基酸，其中前17個氨基酸構成信號肽，序列提交GenBank，登錄號分別為EU022703和EU370914。／n基因DNA序列長1209bp，含有3個內(nèi)含子；全長cDNA序列為

4、1095bp，包含一個編碼291個氨基酸的開放閱讀框，前17個氨基酸構成信號肽。序列在Genbank中注冊，登錄號為EU004197和EU004196。比對分析由核苷酸序列推導的相應氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩個脂肪酶均具有GHSLG，即霉菌脂肪酶保守序列。二者氨基酸同源性為7869％。將基因匆和揚分別與酵母分泌型表達載體pPIC9K雙酶切后體外連接，構建酵母重組表達載體pPIC9K／／gy和pPIC9K／ln，并測序保證正確的閱讀框。將重組表達