嗜熱真菌熱穩(wěn)定纖維素酶的分離純化及基因的克隆與表達(dá).pdf

1、纖維素是地球上最豐富的碳水化合物質(zhì)，可被纖維素酶降解轉(zhuǎn)化成為葡萄糖。具有很好的開發(fā)前景。纖維素酶因其在多領(lǐng)域潛在的應(yīng)用價(jià)值而倍受關(guān)注，它可用于纖維廢物的生物轉(zhuǎn)化，也可用于紡織、造紙、洗滌、飼料加工等工業(yè)領(lǐng)域，還可用于加工單細(xì)胞蛋白，制備酵母和絲狀真菌的原生質(zhì)體，進(jìn)行菌株改良。傳統(tǒng)上采用化學(xué)方法控制纖維素降解難度大、成本高，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，而纖維素的生物降解有效克服了這些問題，不但提高了資源利用效率，而且增加了經(jīng)濟(jì)效益。 纖維素能

2、被千百種真菌、細(xì)菌和放線菌等微生物所降解，生物降解過程很重要的一組酶是纖維素酶。外切葡聚糖纖維二糖水解酶(1，4-β-D-glucan cellobiohydrolase或exo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91)是其中必不可少的一類酶。在水解纖維素過程中，外切葡聚糖纖維二糖水解酶主要作用于纖維素線性分子非還原末端，水解β-1，4-糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，使結(jié)晶纖維素成為易溶解的非結(jié)晶纖維素。β-葡聚糖

3、苷酶(β-1，4-glucosidase，EC3．2．1．21，簡(jiǎn)稱BG)也是纖維素酶系的重要組成成分，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子防止纖維二糖的積聚，減輕其對(duì)纖維素酶的抑制作用，因此該酶對(duì)于纖維素酶系的整體水解活性有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。 嗜熱真菌產(chǎn)生的纖維素酶在高溫條件下具有高活力和穩(wěn)定性，并且與中溫真菌一樣，嗜熱真菌產(chǎn)生的各類纖維素酶普遍含有多種類型的組分。到目前為止，外切葡聚糖纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶在真菌上的研究仍

4、多以中溫真菌為主，嗜熱真菌(Thermophlic fungi)上的研究很少。本實(shí)驗(yàn)室分離的嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum CT2)和埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)是廣泛分布的，生長上限溫度較高的兩種嗜熱真菌，從這兩種菌中均已分離了多種嗜熱纖維素酶，主要是內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。本研究在發(fā)酵過程中檢測(cè)到外切葡聚糖纖維二糖水解酶的活性，說明嗜熱毛殼菌和埃默森籃狀菌是纖維素酶系較齊

5、全的兩種嗜熱真菌。本研究中C.thermophilum CT2在以微晶纖維素為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中液體誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)生胞外纖維素酶,通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子層析、Septlacryl S-100分子篩層析、DEAE-Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子層析等步驟獲得了兩種凝膠電泳均一的外切葡聚糖纖維二糖水解酶和一種口服葡萄糖苷酶，同時(shí)對(duì)該兩種酶的多項(xiàng)理化性質(zhì)進(jìn)行研究。SDS—PAGE測(cè)得所分離純化外切葡

6、聚糖纖維二糖水解酶蛋白的分子量約為66．3kDa和180．3kDa。該兩種酶反應(yīng)的最適溫度分別為65℃－170℃。反應(yīng)的最適pH值分別為5.0和4.0。在60℃以下兩種酶均比較穩(wěn)定，在70℃保溫1h后酶活性仍維持在60％左右，在80℃T保溫20minCBH I具有20％的活性，在90℃T保溫20minCBH II仍具有近10％的活性。相比較而言，具有比CBH I更高的熱穩(wěn)定性。這兩種酶熱穩(wěn)定性較中溫真菌的同類酶高。這兩種酶在pH4.0—

7、7.0之間均比較穩(wěn)定，說明外切葡聚糖纖維二糖水解酶I和II具有一定的耐酸性。以pNPC為底物CBH I的Km值為0.956mmol／L。純化的肛葡萄糖苷酶為單亞基蛋白，相對(duì)分子量在118.0kDa-120.1kDa，其反應(yīng)的最適溫度為70℃，反應(yīng)的最適pH值在4.0—5.0之間。從zemersonii相同培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液中也分離兩種外切葡聚糖纖維二糖水解酶，其中CBHI和CBHII的分子量約為70.0kDa和72.2kDa。其最適反應(yīng)

8、溫度分別為55℃和60℃，最適反應(yīng)pH值為6.0和3.0。在60℃及60*(2以下時(shí)CBHI和CBHII酶基本都是穩(wěn)定的，在70'c時(shí)保溫1h后，CBHII的剩余酶活還能保持在70％左右，其熱穩(wěn)定性較好。CBHI酶在pH5.0—8.0之間較為穩(wěn)定，CBHII在pH3.0—7.0之間的范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，該酶較之CBHI具有很強(qiáng)的耐酸性。以pNPC為底物，CBHI的Km值為0．936mmol/L，CBHII的‰為0.917mmol/L。根據(jù)真

9、菌外切葡聚糖纖維二糖水解酶的氨基酸同源保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過RT-PCR及快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法，克隆了嗜熱毛殼菌CthermophilumCT2熱穩(wěn)定纖維二糖水解酶cbh3基因，cDNA序列全長為1356bp，包含一個(gè)開放閱讀框，編碼451個(gè)氨基酸。該基因已在Genbank中注冊(cè)，登錄號(hào)為DQ085790。同時(shí)提取嗜熱毛殼菌CthermophilumCT2基因組DNA，克隆了該外切酶的部分DNA序列，獲得的序列長1

10、507bp，包含三個(gè)內(nèi)含子區(qū)域。該基因在GenBank中注冊(cè)號(hào)為EF222284。將cbh3基因與酵母表達(dá)載體pPIC9K經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后，體外連接構(gòu)建了酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K／cbh3，將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/cbh3和pPIC9K空質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶SacI(位于5'AOXl區(qū)內(nèi))線性化后，采用電擊法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris GSll5感受態(tài)細(xì)胞，于MD／MM平板上篩選His’Mu

11、t+表型的酵母轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過PCR檢測(cè)及G418抗性篩選多拷貝整合子，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過檢測(cè)各轉(zhuǎn)化子每隔24h的蛋白表達(dá)情況來篩選高效表達(dá)目的纖維二糖水解酶的工程菌株。經(jīng)過槍測(cè)與篩選獲得了轉(zhuǎn)酵母：二程菌株，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量及遺傳穩(wěn)定性，并測(cè)定表達(dá)纖維二糖水解酶CBH的酶學(xué)性質(zhì)。本研究以嗜熱真菌為研究對(duì)象，純化了五種新的纖維素酶，分離了一個(gè)新的纖維素酶基因，并率先嘗試進(jìn)行真核表達(dá)，成功構(gòu)建了能高效表達(dá)目的蛋白的轉(zhuǎn)酵母工程菌株。以上開