26828.嗜熱真菌熱穩(wěn)定纖維素酶的分子改造

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文嗜熱真菌熱穩(wěn)定纖維素酶的分子改造姓名：張亞波申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：環(huán)境生物學(xué)指導(dǎo)教師：李多川20090607嗜熱真菌熱穩(wěn)定纖維素酶的分子改造個(gè)氨基酸均屬于保守性的氨基酸。通過硫酸銨沉淀、DEAE—SepharoseFastFlow陰離子層析、PhenylSepharose疏水層析等步驟純化了該蛋白，酶學(xué)性質(zhì)與野生酶進(jìn)行了比較，并初步探討酶活力提高的可能機(jī)制。利用融合PCR技術(shù)在egl的5’末端連接了來自于嗜熱毛

2、殼菌(CthermophilumCT2)的cbhl基因，經(jīng)測序驗(yàn)證讀碼框正確后，構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5中，篩選到一株表達(dá)量較高的融合基因eglcbhl的酵母工程菌株，命名為GPNl3。該菌株表達(dá)的融合酶的分子量為88kDa，最適溫度和pH分別為50“c和40，對不同底物的酶活力均高于內(nèi)切葡聚糖酶egl的活力。大多數(shù)纖維素水解酶至少由催化區(qū)和結(jié)合區(qū)組成，催化區(qū)含有催化水解纖維素B14糖昔鍵的活性位點(diǎn)；纖維素吸附區(qū)(CBD)，主

3、要功能是結(jié)合纖維素，對纖維素的超分子結(jié)構(gòu)具有特異性，能夠提高酶對纖維素的吸附，從而增加纖維素底物的水解。CBD在纖維素酶對不溶性纖維素底物的水解中起著關(guān)鍵作用，關(guān)于CBD作用的多數(shù)信息，是通過去除該結(jié)構(gòu)域、改變結(jié)構(gòu)域或進(jìn)行定點(diǎn)誘變研究而得到，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)從嗜熱毛殼菌中分離到了cbhl和cbh3基因，cbhl具有完整的結(jié)構(gòu)即：催化區(qū)、結(jié)合區(qū)以及連接兩個(gè)區(qū)域的連接橋；而cbh3缺少結(jié)合區(qū)，本研究在無結(jié)合區(qū)的嗜熱毛殼菌cbh3酶蛋白的C端通過

4、融合PCR技術(shù)連接了cbhl基因的纖維素結(jié)合區(qū)CBD，經(jīng)測序驗(yàn)證讀碼框正確后，構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母中，篩選到一株高表達(dá)量的融合基因cbh3J的酵母工程菌株，命名為GPBl03。該菌株表達(dá)的融合酶蛋白分子量為51kDa，最適溫度和pH分別為60。C和40，濾紙酶活較cbh3提高了12倍，DEAESepharoseFastFlow陰離子層析純化了該蛋白，并對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。關(guān)鍵詞：嗜熱毛殼菌，嗜熱子囊菌光孢變種，熱穩(wěn)定纖維素酶，基因