海洋黑曲霉內(nèi)切纖維素酶的制備與纖維素酶復(fù)配.pdf

1、纖維素酶在生物煉制的纖維素水解中居于核心地位，由三種酶組合而成，分別為纖維素內(nèi)切酶（內(nèi)切-β-葡聚糖酶）、纖維素外切酶（外切-β-葡聚糖酶）和纖維二糖酶（β-葡萄糖苷酶），研究它們中各個酶的酶學(xué)性質(zhì)和組成關(guān)系對纖維素水解十分重要。本實驗室從東海海底淤泥中篩選得到一株產(chǎn)纖維素酶黑曲霉菌株，該菌株能夠表達酶活較高的纖維素酶，在我們以前的工作中對其中的纖維二糖酶進行過詳細的研究，本文將在優(yōu)化產(chǎn)纖維素酶菌種的固態(tài)發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，重點研究纖維素

2、內(nèi)切酶的酶學(xué)性質(zhì)，并研究該菌種所產(chǎn)纖維素酶與里氏木霉纖維素酶復(fù)配效果，分析三種酶的組成關(guān)系，最后以水解稻草粉為例，說明纖維素酶的復(fù)配可能會起到更好的纖維素酶解效果。主要研究內(nèi)容如下:
　　首先，優(yōu)化了海洋黑曲霉纖維素酶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基條件。重點考察了底物、麥麩含量、初始含水量、發(fā)酵時間對該海洋黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。結(jié)果表明在以稻草粉作為底物，麥麩含量為40％，初始含水量為70％，發(fā)酵到第6天時，濾紙酶活和內(nèi)切纖維素酶活達到

3、最高值，分別為9.64±0.37 U· gds-1和205.24±6.94 U· gds-1，而纖維二糖酶在第7天達到最大值76.27±3.13U· gds-1。
　　其次，建立了一條從海洋黑曲霉纖維素酶粗酶液中分離純化內(nèi)切纖維素酶的技術(shù)路線。采用硫酸銨分級沉淀、DEAE-toyopearl離子交換層析和Phenyl Sephadex6FF疏水作用層析兩步層析對其進行分離純化，得到了電泳純的內(nèi)切纖維素酶組分。比活力由37.72U·

4、mg-1提高到557.27 U·mg-1，純化倍數(shù)達到了14.77倍，可用于酶學(xué)性質(zhì)的研究。研究了該內(nèi)切纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)，包括分子量、溫度和pH的穩(wěn)定性，鹽濃度對酶活的影響，金屬離子對酶活的影響。結(jié)果表明該內(nèi)切纖維素酶的分子量約為34 kDa，該酶的最適溫度為60℃，最適pH為4.5，具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。金屬離子對內(nèi)切纖維素酶的酶活影響較大，Cu2+、Fe2+具有一定的激活作用，Mn2+、Ni2+、Zn2+具有強烈的抑制作

5、用。當NaCl濃度為40 g·L-1時具有最佳酶活，在NaCl濃度為20～60 g·L-1的環(huán)境下，其酶活均高于不合NaCl條件下的酶活，在200 g·L-1NaCl高鹽濃度下，該酶尚能保持初始酶活的89％，基本確定，該酶是典型的耐鹽型酶。對該酶的酶促進反應(yīng)動力學(xué)進行研究發(fā)現(xiàn)其在pH4.5、60℃條件下米氏常數(shù)Km為11.7mg·mL-1， Vmax為943.4U·mg-1。
　　第三，在分析海洋黑曲霉與里氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶組成

6、基礎(chǔ)上，研究了海洋黑曲霉與里氏木霉纖維素酶復(fù)配協(xié)同作用效果及酶學(xué)性質(zhì)。將里氏木霉纖維素酶與海洋黑曲霉纖維素酶按不同比例進行混合，考察兩者的協(xié)同作用，結(jié)果表明當復(fù)配纖維素酶酶系組成為濾紙酶活∶纖維二糖酶活(FPase∶Cellobiase)=1∶2時，協(xié)同作用達到最大，此時實際測得的FPase提高了43.9％。對復(fù)配纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)配纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)基本介于海洋黑曲霉纖維素酶和里氏木霉纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)之間。其濾紙酶活、內(nèi)切

7、纖維素酶活、纖維二糖酶活最適pH均為5.0，最適溫度分別為50℃、50℃、60℃。復(fù)配纖維素酶50℃下保溫48小時，48小時后相對于里氏木霉纖維素酶尚能保持較高活力。耐鹽性方面復(fù)配纖維素酶也優(yōu)于里氏木霉纖維素酶，當NaCl濃度為20％時，其能保持初始酶活力的50％以上。
　　最后，考察了海洋黑曲霉固態(tài)發(fā)酵和里氏木霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的纖維素酶以及二者的復(fù)配纖維素酶水解稀酸預(yù)處理過的稻草粉的效果。底物用量為20g·L-1，纖維素酶用量為2

8、0U·(g substrate)-1，50℃下反應(yīng)48h，復(fù)配纖維素酶產(chǎn)生的還原糖濃度為8.4 g·L-1，里氏木霉和海洋黑曲霉纖維素酶產(chǎn)生的還原糖濃度分別為6.5 g·L-1和4.1 g·L-1，三者對應(yīng)的葡萄糖濃度分別為7.6 g·L-1、5.7g·L-1和3.4g·L-1，水解效率分別為54.72％、41.04％和24.08％，復(fù)配纖維素酶相對于里氏木霉纖維素酶和海洋黑曲霉纖維素酶水解效率分別提高了33.3％和123.5％。以上結(jié)