嗜熱真菌纖維二糖水解酶(CBHⅠ、CBHⅡ)和內(nèi)切葡聚糖酶(EGⅠ)的分子改造.pdf

1、纖維素酶自1906年Seilliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直是研究的熱點(diǎn)，那是因?yàn)槔w維素廢料是地球上最豐富的可再生資源，利用纖維素酶對(duì)其降解既無(wú)污染又可以得到各種有用的產(chǎn)物，是一條變廢為寶的好途徑；再者纖維素酶已經(jīng)被應(yīng)用在紡織、造紙、飼料、食品加工以及洗滌劑生產(chǎn)等工業(yè)領(lǐng)域；目前利用纖維素酶降解木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇又成為了研究熱點(diǎn)。因此，能獲得一個(gè)高產(chǎn)纖維素酶菌株，并且其酶活力、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性等酶學(xué)指標(biāo)都能滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)的需要

2、，這是每個(gè)纖維素酶研究者夢(mèng)寐以求的。
　　 本實(shí)驗(yàn)室一直從事嗜熱真菌產(chǎn)酶的研究，分離到了嗜熱子囊菌光孢變種（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）和嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum CT2）產(chǎn)酶菌株，其生長(zhǎng)上限溫度較高，產(chǎn)生的纖維素酶的活性及耐熱性都很高，具有極大的研究和應(yīng)用價(jià)值。本研究先構(gòu)建來(lái)源于嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum CT2

3、）的纖維二糖水解酶Ⅱ和纖維二糖水解酶Ⅰ的工程菌WTCBHⅡ、WTCBHⅠ，然后利用定向進(jìn)化的方法對(duì)其進(jìn)行改造。采用易錯(cuò)PCR方法建立突變體庫(kù)后，以高活力作為篩選壓力，先后以小量發(fā)酵法和搖瓶發(fā)酵法篩選突變體庫(kù)。對(duì)工程菌WTCBHⅡ進(jìn)行定向進(jìn)化得到了兩株酶活力是出發(fā)菌株所產(chǎn)酶活力的3倍的突變菌株：CBHⅡX16和CBHⅡX305，測(cè)得的序列與野生基因比較，發(fā)現(xiàn)CBHⅡX16中有5個(gè)氨基酸發(fā)生突變，它們是R1S、A29T、L203Y,、Q20

4、4K和 E252G；CBHⅡX305中有6個(gè)氨基酸發(fā)生突變，它們是A29T,、T115I,、I195V、L203Y,、Q204K和 E252G。對(duì)工程菌WTCBHⅠ進(jìn)行定向進(jìn)化得到了兩株酶活力是出發(fā)菌株所產(chǎn)酶活力的2倍的突變菌株：CBHⅠX88和CBHⅠX26，測(cè)得的序列與野生基因比較，發(fā)現(xiàn)CBHⅠX88有10個(gè)突變位點(diǎn)它們是C13Y、S15P、S84P、N86D、N179D、D212E、C225R、M348K、D383G和S412G；

5、CBHⅠX260有7個(gè)突變位點(diǎn)它們是C13Y、S15P、S101Y、M208T、D212E、N290T和Q473R。通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等步驟純化了突變蛋白，酶學(xué)性質(zhì)與野生酶進(jìn)行了比較，突變酶在最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值和熱穩(wěn)定性方面都有提高。
　　 用同源建模的方法對(duì)6個(gè)工程菌所產(chǎn)酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)突變酶性質(zhì)改變的可能機(jī)制從空間結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)在突變酶CBHⅡX16和CBH

6、ⅡX305的L203 Y、CBM1中A29T，可能與酶活提高有關(guān)；K204Q、E252G、突變位點(diǎn)29和位點(diǎn)37、突變位點(diǎn)203和位點(diǎn)227之間氫鍵的增加都有利于突變酶的穩(wěn)定性，T115I有利于熱穩(wěn)定性的提高，Q204K、E252G與突變酶最適反應(yīng)pH值提高可能有關(guān)；在突變酶CBHⅠX88中的C225R和突變酶CBHⅠX260中的M208T，都是位于劈開(kāi)纖維素的活性位點(diǎn)附近，CBHⅠX260中的Q473R是位于結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM），它們

7、的改變可能與提高酶活有關(guān)；兩個(gè)突變酶的突變位點(diǎn)C13Y、S15P、S84P、C225R，這些改變的氨基酸的側(cè)鏈都比原來(lái)的變大而復(fù)雜了，加強(qiáng)了包埋效應(yīng)，提高了熱穩(wěn)定性，C225R、M348K和Q473R，R和K都是堿性氨基酸，可能是突變酶反應(yīng)pH值升高的原因。
　　 利用定點(diǎn)突變的方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建成功的來(lái)自嗜熱子囊菌光孢變種（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）的內(nèi)切葡聚糖酶eg1進(jìn)

8、行分子改造，先對(duì)比了多個(gè)纖維素酶第5家族（Cel5）內(nèi)切葡聚糖酶序列，排除共同保守的氨基酸，選擇其附近的非保守氨基酸作為突變點(diǎn)。選擇了5個(gè)突變位點(diǎn)：N41D、L52M、Y129H、W165Y和H193A。通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等步驟純化了點(diǎn)突變突工程菌L52M EG1、Y129H EG1和W165Y EG1所產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖酶，酶學(xué)性質(zhì)與野生酶進(jìn)行了比較，突變酶在最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值和熱穩(wěn)定性