瑞氏木霉纖維二糖水解酶(CBHⅠ)絲狀真菌表達(dá)體系的構(gòu)建.pdf

1、結(jié)晶纖維素的降解是提高纖維素利用效率的關(guān)鍵之一。瑞氏木霉可以分泌產(chǎn)生高效降解結(jié)晶纖維素的酶系，其中纖維二糖水解酶(CBH I)約占其胞外分泌總蛋白的60％。CBH I能夠從結(jié)晶纖維素的還原端連續(xù)催化形成纖維二糖，是高效降解結(jié)晶纖維素的重要的酶組分。但現(xiàn)有纖維素酶作用于天然纖維素高分子底物時(shí)，酶解效率較低，難以滿(mǎn)足工業(yè)化轉(zhuǎn)化的需要。隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，利用定點(diǎn)突變等方法研究纖維素酶的催化關(guān)鍵氨基酸及催化機(jī)制，分析酶解效率的限制

2、性因素，可以為提高纖維素的酶解效率提供理論基礎(chǔ)。
　　 瑞氏木霉纖維二糖水解酶雙結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)組成，在分泌過(guò)程中的翻譯后修飾及其復(fù)雜的折疊過(guò)程被認(rèn)為是纖維二糖水解酶異源表達(dá)困難的主要原因。研究表明，大腸桿菌和酵母菌都不是纖維二糖水解酶表達(dá)的合適宿主。在大腸桿菌中缺乏必要的翻譯后修飾，表達(dá)容易形成包涵體。而在酵母中存在過(guò)度糖基化問(wèn)題，表達(dá)的纖維二糖水解酶的活性較低。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)存在重組蛋白表達(dá)量低，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)及成本昂貴等問(wèn)題。纖

3、維素酶特別是纖維二糖水解酶的高效異源表達(dá)一直是制約其結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系深入研究的瓶頸。絲狀真菌具有很高的蛋白分泌能力，具有高效的蛋白折疊分泌體系。因此，絲狀真菌可能是包括纖維二糖水解酶在內(nèi)的纖維素酶良好的表達(dá)宿主。
　　 本文通過(guò)在黑曲霉和瑞氏木霉中重組表達(dá)纖維二糖水解酶(CBH I)，從而嘗試建立重要纖維素酶組分的高效絲狀真菌表達(dá)體系。本文首先構(gòu)建了黑曲霉高效轉(zhuǎn)化體系，研究了影響黑曲霉原生質(zhì)體制備的裂解酶，培養(yǎng)方式及菌齡等因素。結(jié)

4、果表明，Lysing Enzyme可以用來(lái)有效地制備瑞氏木霉原生質(zhì)體，但是對(duì)黑曲霉的細(xì)胞壁幾乎沒(méi)有裂解作用。Cellulase的作用同樣很微弱，而Snailase可以裂解黑曲霉產(chǎn)生少量原生質(zhì)體(～104/ml)。Lywallzyme可以裂解黑曲霉細(xì)胞壁，釋放大量原生質(zhì)體(～107/ml)。利用Lywallzyne和Snailase混合酶系統(tǒng)制備黑曲霉原生質(zhì)體效果最佳。黑曲霉液體培養(yǎng)極易形成菌絲球，不利于原生質(zhì)體的制備。高速振蕩培養(yǎng)(30

5、0 rpm)和靜置培養(yǎng)都可以得到較為松散的菌絲，但是高速振蕩培養(yǎng)制備原生質(zhì)體的效果較靜置培養(yǎng)效果好。菌齡是影響原生質(zhì)體制備的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，菌齡為14h制備原生質(zhì)體數(shù)量最多，而菌齡為16h制備的原生質(zhì)體再生數(shù)量最多。幼嫩的菌絲得到原生質(zhì)體數(shù)量較多，但是原生質(zhì)體較脆弱，再生能力較低，16h制備原生質(zhì)體效果最佳。綜合以上實(shí)驗(yàn)，確定黑曲霉原生質(zhì)體制備的最佳條件為：在滲透壓穩(wěn)定劑(l M山梨酵，10 mMKH2P04-K2HP04 pH5.

6、8)存在下，10 mg/ml Lywanzyme+10 mg/ml Snailase在30℃下作用于300 rpm震蕩培養(yǎng)16h的菌絲2h，原生質(zhì)體的制備效率可達(dá)107～108個(gè)/ml。我們進(jìn)一步利用PEG-CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒pAB4-1（含pyrG基因）成功轉(zhuǎn)化黑曲霉MGG029得到轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化率為200個(gè)/ug DNA。
　　 在成功構(gòu)建黑曲霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)融合PCR的方法將CBH I基因置于黑曲

7、霉強(qiáng)啟動(dòng)子-葡萄糖淀粉酶(glaA)啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建了CBH I在黑曲霉中的表達(dá)質(zhì)粒pAN56-CBH，進(jìn)一步將黑曲霉pyrG的表達(dá)盒連接到pAN56-CBH上獲得質(zhì)粒pAN56-CBH-pyrG，以便于黑曲霉的轉(zhuǎn)化。通過(guò)PEG-CaC12介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將CBH I的表達(dá)載體pAN56-CBH-pyrG轉(zhuǎn)入黑曲霉MGG029，得到約200株轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)western blot篩選驗(yàn)證得到了CBH I表達(dá)的轉(zhuǎn)化子。對(duì)重組表

8、達(dá)的CBH I進(jìn)行了初步純化，其分子量約在58-80kDa之間，以pNPC及Avicel pH101為底物測(cè)定酶活表明重組表達(dá)的CBHI有活性。
　　 瑞氏木霉和黑曲霉分泌蛋白的糖基化形式有差異，在黑曲霉中表達(dá)瑞氏木霉CBH I出現(xiàn)的過(guò)度糖基化修飾可能對(duì)CBH I的性質(zhì)會(huì)有影響。因此我們還嘗試進(jìn)一步構(gòu)建瑞氏木霉表達(dá)體系。利用組成型啟動(dòng)子丙酮酸激酶啟動(dòng)子(pki)和cbh2終止子構(gòu)建了在瑞氏木霉中的組成型表達(dá)載體pRLMex-CB