β-瓊膠酶的純化及新瓊二糖水解酶AgWH117A結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、瓊膠酶是一類(lèi)能夠降解瓊膠生成瓊膠寡糖的酶。根據(jù)斷裂方式的不同可分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶。瓊膠酶的應(yīng)用非常廣泛:可作為工具酶分離海藻中的原生質(zhì)體;回收瓊脂糖凝膠中DNA和分析海藻細(xì)胞壁中多糖成分。另外瓊膠酶降解瓊脂產(chǎn)生的瓊膠寡糖由于其顯著的生物學(xué)活性，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。本文從青島近海的紅藻中篩選得到一株高產(chǎn)瓊膠酶菌株，并通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化之后，分離純化得到2種功能良好的β-瓊膠酶;同時(shí)對(duì)本課題組表達(dá)成功的新瓊二糖水解酶AgWH1

2、17A進(jìn)行了結(jié)晶以及結(jié)構(gòu)解析。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下:
　　(1)從青島近海紅藻類(lèi)以及印尼海泥中篩選得到了6株海洋產(chǎn)瓊膠酶菌株。經(jīng)過(guò)16S rRNA測(cè)序鑒定，確定其分別屬于Pseudoalteromonas sp.、Agarivoransalbus.、Vibrio lentus和Microbulbifer sp.，并對(duì)其中產(chǎn)瓊膠酶活性高的菌株進(jìn)行了菌株鑒定其為Agarivorans albus，并命名其為Agarivorans a

3、lbus OAY2。為提高OAY2菌株的產(chǎn)酶量，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。確定其最佳優(yōu)化條件為蛋白胨0.49 g/L，酵母粉1.08 g/L，pH9.85。酶活由原來(lái)的1.06 U/mL提高到2.65 U/mL。
　　(2)從Agarivorans albus OAY2發(fā)酵液中，純化得到了2個(gè)β-瓊膠酶，分別命名為瓊膠酶a和瓊膠酶b。發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀，硫酸銨飽和度為60％時(shí)，酶獲得最佳比活。優(yōu)化蛋白純化條件，發(fā)現(xiàn)瓊膠酶a在20

4、 mM，pH6.0的磷酸鹽緩沖液中經(jīng)DEAE柱子可以得到純度較高的蛋白;瓊膠酶b在20 mM，pH7.0的Tris-Hcl緩沖液中經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱Q柱，可以達(dá)到純度較高的蛋白。瓊膠酶a和b純化之后的回收率分別為0.16％和0.09％，比活由原來(lái)的25.26 U/mg分別提高到了2715 U/mg和1338 U/mg。
　　瓊膠酶a，b的分子量分別為50 kDa和107 kDa。瓊膠酶a的最適溫度與pH分別為40℃和9.0，瓊膠酶b

5、的最合溫度與pH為50℃和9.0。Cu2+，Co2+，Mn2+對(duì)瓊膠酶a，b有很大的抑制作用，而DTT對(duì)這兩個(gè)酶有很大的促進(jìn)作用。13C-NMR和TLC結(jié)果顯示瓊膠酶a的主要產(chǎn)物是新瓊二糖(NA2)，新瓊四糖(NA4)和新瓊六糖(NA6)。瓊膠酶b的只要產(chǎn)物是八糖以上的糖，但是它也可長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)生成NA2。根據(jù)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF/MS)結(jié)果顯示，瓊膠酶a屬于糖苷水解酶(GH)118家族，瓊膠酶b屬

6、于GH50家族。
　　(3)新瓊二糖水解酶AgWH117A能夠降解新瓊寡糖生成瓊寡糖和內(nèi)醚半乳糖，是微生物代謝瓊脂的關(guān)鍵酶之一，也是生產(chǎn)奇數(shù)瓊寡糖和內(nèi)醚半乳糖的重要工具酶。
　　經(jīng)過(guò)X-射線衍射得到新瓊二糖水解酶AgWH117A的三維結(jié)構(gòu)。對(duì)比NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中有結(jié)晶的蛋白質(zhì)氨基酸序列為α-NABH(Saccharophagus Degradans2-40)其相似性最高的為74％?；钚晕稽c(diǎn)關(guān)鍵氨基酸其同為廣義堿Asp52-As

7、p207和廣義酸Glu207。在AgWH117A的三維結(jié)構(gòu)中，一個(gè)不對(duì)稱(chēng)單元有兩個(gè)分子，空間位置是p21位，推測(cè)其催化機(jī)制是保留機(jī)制。
　　利用“TK-SA”模型探索影響AgWH117A酶活熱穩(wěn)定性氨基酸位點(diǎn)?！癟K-SA”模型是以氨基酸之間的相互作用力為依據(jù)，計(jì)算出分子間斥力，排除斥力較大的氨基酸，活性位點(diǎn)的氨基酸以及l(fā)oop環(huán)上的氨基酸。通過(guò)11個(gè)位點(diǎn)的丙氨酸掃描之后，發(fā)現(xiàn)能夠提高AgWH117A酶活熱穩(wěn)定性的突變體。

8、　　(4)本研究純化得到的瓊膠酶a，b在較廣泛的溫度與pH范圍內(nèi)具有很高的活性。較好的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性增加了其在工業(yè)當(dāng)中的應(yīng)用。酶a與酶b的產(chǎn)物豐富，包括NA2、NA4、NA6、NA8等糖。不僅這兩個(gè)酶，這個(gè)菌株Agarivorans albus OAY02也值得我們進(jìn)一步研究。
　　通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)晶獲得了在瓊膠酶降解菌中關(guān)鍵酶之一，AgWH117A的晶體結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)的獲得，能夠更好的闡述其作用機(jī)制，并為改造酶提供更加科學(xué)的依