灰蓋鬼傘菌蓋多糖水解酶的分離純化、鑒定及生理功能研究.pdf

1、真菌多糖水解酶的研究有很多報道，其中很多水解酶都參與了其菌絲或子實體的自溶。對于自溶已經(jīng)有了深入的認(rèn)識，從最初認(rèn)為的是在惡劣環(huán)境條件下細(xì)胞死亡的過程，到現(xiàn)在普遍認(rèn)為的有著精密復(fù)雜調(diào)控機制的具有重要生理功能的過程，對真菌的生存、孢子形成和傳播等都有重要意義。但關(guān)于真菌自溶的機理還需要更加深入的研究。擔(dān)子菌特別是其中的傘菌，在子實體成熟后都有快速的自溶現(xiàn)象，所以我們以一種模式真菌灰蓋鬼傘為研究對象，從其中多糖水解酶對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的水解作用角度

2、，闡釋真菌自溶的機理。
　　本文以灰蓋鬼傘為研究材料，用硫酸銨鹽析、陰陽離子交換層析、高效液相色譜層析的方法，從灰蓋鬼傘菌蓋中分離純化出一系列具有β-1，3-葡聚糖酶活性的葡聚糖酶和一個外切幾丁質(zhì)酶。質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果表明，這幾種葡聚糖酶分別為胞外β-糖苷酶、外切-β-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖β-1，3-糖苷酶和糖苷家族16蛋白，然而經(jīng)過底物特異性和作用方式分析結(jié)果顯示，它們實際分別為β-糖苷酶、β-1，3-糖苷酶、外切-β-1，3

3、-葡聚糖酶和內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶。底物特異性結(jié)果表明胞外β-糖苷酶不是專一的β-1，3-糖苷水解酶，對β-1，3/1，4/1，6糖苷鍵都能水解。用薄層層析色譜方法分析三種β-1，3-糖苷水解酶與昆布多糖的水解產(chǎn)物，結(jié)果表明這三種β-1，3-糖苷水解酶發(fā)揮協(xié)同水解作用:內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶昆布多糖內(nèi)部的糖苷鍵產(chǎn)生各種長度的β-1，3-寡糖，外切-β-1，3-葡聚糖酶再將較長鏈的寡糖水解為短鏈的二糖、昆布二糖和龍膽二糖，最后β-

4、1，3-糖苷酶水解昆布二糖產(chǎn)生葡萄糖。殘留的龍膽二糖還需要其它β-1，6-糖苷酶來水解，胞外β-糖苷酶可能就在此發(fā)揮水解作用。因此，我們推測在灰蓋鬼傘子實體自溶過程中β-1，3-糖苷酶、外切-β-1，3-葡聚糖酶和內(nèi)切-β-1，3-葡聚糖酶協(xié)同作用降解細(xì)胞壁的β-1，3-葡聚糖骨架。此外，這三種β-1，3-糖苷水解酶的最適pH和最適溫度都相同，分別為5.0和60℃，說明它們可能在相同的條件下工作，也從側(cè)面支持了上述協(xié)同作用的推測。同時從

5、灰蓋鬼傘菌蓋中用硫酸銨鹽析和弱陽離子交換色譜層析的方法，分離純化得到的一種具有幾丁質(zhì)酶活性的蛋白，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定為V型幾丁質(zhì)酶ChiB1。底物特異性和離子色譜層析分析表明ChiB1為一種外切幾丁質(zhì)酶。ChiB1的最適pH為5.0，最適溫度為35-40℃，以膠態(tài)幾丁質(zhì)為底物的Km和Vmax分別為2.63mg ml-1和2.31μmol min-1 mg。ChiB1水解灰蓋鬼傘堿不溶細(xì)胞壁多糖的產(chǎn)物中含有大量的可溶性β-葡聚糖，因此，我們認(rèn)為

6、幾丁質(zhì)酶ChiB1通過水解細(xì)胞壁多糖中的幾丁質(zhì)鏈從而暴露出大量的β-1，3或β-1，6葡聚糖非還原末端或者直接釋放出β-1，3或β-1，6葡聚糖分子，與β-葡聚糖酶協(xié)同作用降解細(xì)胞壁促進菌蓋的自溶，在子實體自溶中具有重要意義。通過對灰蓋鬼傘子實體葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶生理功能的研究，我們認(rèn)為葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶都參與子實體的自溶，外切幾丁質(zhì)酶ChiB1（可能還有其他幾丁質(zhì)酶，如自溶中同樣高表達(dá)的Ⅲ類幾丁質(zhì)酶）水解細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，暴露出更多