旋毛蟲(chóng)Nudix水解酶的克隆表達(dá)與功能鑒定.pdf

1、自1835年旋毛蟲(chóng)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)尚無(wú)有效的預(yù)防疫苗。旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)囊包經(jīng)口感染宿主后，在胃液的作用下幼蟲(chóng)自囊包內(nèi)逸出，在膽汁作用下發(fā)育為腸道感染性幼蟲(chóng)，然后侵入腸黏膜經(jīng)4次蛻皮發(fā)育為成蟲(chóng)。因此，旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)侵入腸黏膜繼續(xù)發(fā)育是旋毛蟲(chóng)感染宿主的關(guān)鍵步驟，但旋毛蟲(chóng)侵入腸黏膜的機(jī)制尚不完全清楚。由于旋毛蟲(chóng)口孔無(wú)齒狀及矛狀結(jié)構(gòu)，幼蟲(chóng)侵入腸上皮細(xì)胞（IECs）不是簡(jiǎn)單的機(jī)械性侵入，很可能與幼蟲(chóng)表面或者口孔分泌的一些蛋白有關(guān)，這些蛋白可能與IECs相互作用而

2、促進(jìn)了幼蟲(chóng)的侵入。
　　我們課題組前期應(yīng)用Western blot與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析感染性幼蟲(chóng)與IECs共孵育后蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)有64種旋毛蟲(chóng)蛋白進(jìn)入了IECs內(nèi)，其中部分蛋白具有水解酶（如Nudix水解酶）活性；隨后，又從旋毛蟲(chóng)腸道感染性幼蟲(chóng)T7噬菌體展示文庫(kù)與感染性幼蟲(chóng)消減cDNA文庫(kù)篩選到4個(gè)表達(dá)上調(diào)且能與IECs結(jié)合的旋毛蟲(chóng)基因，其中1個(gè)為旋毛蟲(chóng)Nudix水解酶（TsNd）基因。Nudix超家族主

3、要是由焦磷酸水解酶組成，催化的底物是一類(lèi)與核苷二磷酸相連的殘基X化合物（NDP-X）；一些Nudix超家族成員具有降解潛在突變和降解氧化核苷酸的能力，而其他超家族成員可控制新陳代謝中間物和信號(hào)復(fù)合物的合成水平。我們課題組的研究發(fā)現(xiàn)，T7噬菌體展示的TsNd多肽可與小鼠IECs結(jié)合，免疫小鼠后可產(chǎn)生明顯的免疫保護(hù)作用；應(yīng)用RNAi干擾旋毛蟲(chóng)TsNd基因后，幼蟲(chóng)對(duì)IECs的侵入率明顯下降；將TsNd DNA疫苗免疫小鼠后，可產(chǎn)生抗旋毛蟲(chóng)感染

4、的部分免疫保護(hù)作用；提示TsNd可能在旋毛蟲(chóng)侵入IECs過(guò)程中具有重要作用，但關(guān)于TsNd的生物學(xué)特性、功能、與宿主的相互作用及其機(jī)制均不清楚。
　　本課題克隆表達(dá)了TsNd，應(yīng)用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)TsNd的生物學(xué)特性與功能進(jìn)行了分析；應(yīng)用ELISA的方法評(píng)價(jià)重組TsNd（rTsNd）對(duì)旋毛蟲(chóng)病血清學(xué)診斷的價(jià)值；使用右旋葡萄糖硫酸鈉（DSS）腸炎模型觀察了rTsNd對(duì)化學(xué)性誘導(dǎo)腸炎的免疫預(yù)防效果及其機(jī)制。本課題對(duì)于闡明TsNd與宿主IE

5、Cs相互作用的機(jī)制具有重要的科學(xué)意義，并可為研制高保護(hù)性效果的旋毛蟲(chóng)病疫苗及旋毛蟲(chóng)蛋白抗炎新藥等奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)小鼠、旋毛蟲(chóng)、質(zhì)粒和菌株及細(xì)胞
　　本研究使用的小鼠包括BALB/c小鼠、昆明小鼠及C57BL/6小鼠；旋毛蟲(chóng)包括旋毛蟲(chóng)（T1，ISS534），鄉(xiāng)土旋毛蟲(chóng)（T2，ISS10）、布氏旋毛蟲(chóng)（T3，ISS100）、偽旋毛蟲(chóng)（T4，ISS13）及納氏旋毛蟲(chóng)（T7，ISS29）。克隆和表達(dá)菌

6、分別為大腸埃希菌JM109和BL21(DE3)；克隆載體為pGEM-T，表達(dá)質(zhì)粒為pMAL-c2X。小鼠小腸上皮細(xì)胞（IECs）為本課題組前期分離得到，小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）、乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK）、小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7及小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（WT macrophage）均由其他實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。
　　2. TsNd的生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)與鑒定
　　應(yīng)用ORF Finder、ExPASy服務(wù)器、ProtScale

7、程序、TMHMM Server v.2.0、DNAstar Protean軟件等生物信息分析軟件對(duì)TsNd的生物學(xué)信息進(jìn)行分析；然后對(duì)TsNd基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，用Western blot分析rTsNd的抗原性及免疫原性；將純化的rTsNd免疫小鼠，制備抗rTsNd血清，分析其免疫應(yīng)答類(lèi)型及抗旋毛蟲(chóng)攻擊感染的免疫保護(hù)作用。
　　3. TsNd的生物學(xué)特性及功能分析
　　用qPCR及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFT）對(duì)TsNd的

8、轉(zhuǎn)錄水平、表達(dá)時(shí)相及在蟲(chóng)體組織的定位進(jìn)行分析；應(yīng)用Ames和Dubin的方法及高效液相色譜（HPLC）對(duì)rTsNd的酶活性進(jìn)行分析；應(yīng)用旋毛蟲(chóng)體外侵入IECs模型，對(duì)旋毛蟲(chóng)侵入不同細(xì)胞的敏感性、rTsNd與抗rTsNd血清對(duì)旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)侵入IECs的促進(jìn)或抑制作用進(jìn)行分析；應(yīng)用Far Western、IFT及激光共聚焦顯微鏡對(duì) rTsNd與IECs的相互作用進(jìn)行分析。通過(guò)抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）實(shí)驗(yàn)觀察抗rTsNd抗體

9、對(duì)旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒性作用。
　　4. rTsNd用于旋毛蟲(chóng)病診斷
　　應(yīng)用肌幼蟲(chóng)排泄分泌（ES）抗原與rTsNd分別建立檢測(cè)旋毛蟲(chóng)抗體IgG的ES-ELISA與rTsNd-ELISA方法，檢測(cè)不同旋毛蟲(chóng)、其他蟲(chóng)種及不同時(shí)間旋毛蟲(chóng)感染小鼠后血清抗體水平，分析rTsNd-ELISA診斷旋毛蟲(chóng)病的敏感性與特異性。觀察rTsNd-ELISA對(duì)旋毛蟲(chóng)早期感染的診斷效果。
　　5. rTsNd對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的免疫治療效果及其機(jī)制

10、
　　將rTsNd腹腔免疫小鼠（以PBS腹腔注射為對(duì)照組），然后用2.5％DSS誘導(dǎo)2組小鼠化學(xué)性結(jié)腸炎，每天觀察小鼠的身體狀況并記錄其體重，誘導(dǎo)后第10天將小鼠用CO2處死，收集小鼠血清、結(jié)腸，分離脾臟和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞；根據(jù)小鼠體重及結(jié)腸炎癥變化分析rTsNd免疫后對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的免疫預(yù)防效果；通過(guò)檢測(cè)小鼠血清抗體（IgG1、IgG2a及IgE）、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的水平及rTsNd在體外對(duì)脂多糖（LP

11、S）刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子的影響，分析rTsNd對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的可能作用機(jī)制。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　使用SPSS17.0及Graphpad Prism軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，rTsNd抗原檢測(cè)旋毛蟲(chóng)抗體敏感性和特異性及旋毛蟲(chóng)感染后不同時(shí)期抗體水平使用卡方檢驗(yàn)和重復(fù)測(cè)量方差分析，其他多組間的比較使用方差分析，兩組之間的比較使用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1．T

12、sNd的生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)與鑒定
　　TsNd基因序列分析顯示，TsNd基因開(kāi)放閱讀框架（ORF）為堿基全長(zhǎng)的第111到1358位，總長(zhǎng)1248bp，編碼415個(gè)氨基酸，蛋白分子量大小為46 kDa,等電點(diǎn)為8.85，含有一個(gè)跨膜螺旋區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，具有良好的抗原性，有兩個(gè)保守區(qū)，分別是Nudix模體和YhfT, Nudix模體為Nudix水解酶的活性位點(diǎn)和金屬結(jié)合位點(diǎn)。
　　利用克隆表達(dá)技術(shù)，成功構(gòu)建了pMAL-c2X

13、-TsNd重組表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果表明本研究克隆的TsNd與Genbank中TsNd的序列一致性為99.3%；序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示TsNd與偽旋毛蟲(chóng)Nudix水解酶的相似性最高、系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系最近。重組質(zhì)粒能在大腸埃希菌BL21（DE3）中表達(dá)出可溶性的rTsNd。SDS-PAGE結(jié)果表明rTsNd的分子量為89kDa（46 kDa+43 kDa MBP tag）,與預(yù)測(cè)的rTsNd的分子量一致。Western blot分析發(fā)現(xiàn)rTs

14、Nd可被旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清、rTsNd免疫小鼠血清所識(shí)別；rTsNd免疫小鼠血清可識(shí)別旋毛蟲(chóng)腸道感染性幼蟲(chóng)、肌幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)和新生幼蟲(chóng)粗抗原及肌幼蟲(chóng)ES抗原中的天然TsNd蛋白。將rTsNd免疫小鼠3次后ELISA檢測(cè)小鼠抗rTsNd抗體滴度為1:106，血清抗rTsNd IgG1明顯高于IgG2a，表明rTsNd免疫小鼠后產(chǎn)生了Th2型為主的免疫應(yīng)答。對(duì)免疫小鼠用300條旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)攻擊感染后3d與35d，腸道成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率分別為57.

15、70%和56.9%，表明rTsNd免疫小鼠后對(duì)旋毛蟲(chóng)感染可產(chǎn)生部分免疫保護(hù)作用。
　　2. TsNd的生物學(xué)特性與功能
　　通過(guò)PCR和IFT分析發(fā)現(xiàn)TsNd基因在旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育期（肌幼蟲(chóng)、腸道感染性幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)、胚胎、新生幼蟲(chóng)）均有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并且在感染性幼蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平較高；肌幼蟲(chóng)蟲(chóng)體石蠟切片IFT顯示，TsNd主要定位于蟲(chóng)體的表皮、生殖原基及生殖器官部位。酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rTsNd具有天然的Nudix水解酶活性，能

16、對(duì)dGTP, NAD, NADP和CoA產(chǎn)生水解作用，并對(duì)dGTP的水解作用最強(qiáng)。經(jīng)HPLC分析，rTsNd對(duì)dGTP水解作用的最適條件為37℃、pH8.0及有Zn2+存在。旋毛蟲(chóng)對(duì)不同細(xì)胞侵入的敏感性研究顯示，旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)對(duì)IECs的侵入率最高（31.55%），C2C12與BHK細(xì)胞對(duì)旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的侵入不敏感，表明旋毛蟲(chóng)對(duì)細(xì)胞的侵入具有特異性與選擇性。IFT結(jié)果表明， rTsNd能夠與IECs及小腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合，但不能與C2C12細(xì)

17、胞、BHK細(xì)胞及肺組織結(jié)合；激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)rTsNd可特異性的結(jié)合在IECs細(xì)胞膜上；Far Western分析顯示rTsNd可與IECs的10個(gè)蛋白條帶結(jié)合，提示rTsNd能夠與IECs中的蛋白產(chǎn)生相互作用。體外侵入實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rTsNd對(duì)旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)侵入IECs具有促進(jìn)作用，抗rTsNd血清組幼蟲(chóng)對(duì)IECs的侵入率明顯低于正常血清組（9.83%vs33.96%；χ2=18.15, P<0.01），且抗rTsNd血清對(duì)幼蟲(chóng)侵入IECs

18、的抑制作用具有抗體劑量依賴(lài)性。ADCC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗rTsNd血清與正常血清組肌幼蟲(chóng)死亡率分別為76.16%和22.75%，腸道感染性幼蟲(chóng)的死亡率分別為66.84%和9.92%，兩組血清幼蟲(chóng)的死亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明抗rTsNd抗體參與了ADCC過(guò)程，可能與rTsNd免疫小鼠后產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用有關(guān)。
　　3．rTsNd對(duì)旋毛蟲(chóng)病血清學(xué)診斷的潛在價(jià)值
　　應(yīng)用rTsNd-ELISA檢測(cè)旋毛蟲(chóng)感染小鼠不

19、同時(shí)間血清抗體，結(jié)果顯示：rTsNd及旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)ES抗原對(duì)旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清的敏感性均為100%（30/30），特異性分別為100%(54/54)和98%(53/54),兩種抗原特異性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；rTsNd抗原與弓形蟲(chóng)、裂頭蚴感染小鼠血清和正常小鼠血清無(wú)交叉反應(yīng)。rTsNd對(duì)不同種旋毛蟲(chóng)感染小鼠的特異性的檢測(cè)結(jié)果顯示：rTsNd和ES抗原在檢測(cè)T2、T3和T7感染小鼠血清抗體陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0

20、5）,而檢測(cè)T4感染小鼠血清抗體的陽(yáng)性率分別為63.64%和90.91%（P<0.05），提示TsNd可能在成囊型旋毛蟲(chóng)（T1、T2、T3和T7）具有較高的表達(dá)并能被其抗血清識(shí)別，但在非成囊型旋毛蟲(chóng)（T4）的表達(dá)水平較低。rTsNd-ELISA和ES-ELISA對(duì)旋毛蟲(chóng)感染小鼠的早期血清檢測(cè)結(jié)果表明，ES抗原最早檢測(cè)出抗體陽(yáng)性的時(shí)間為感染后10d，而rTsNd為感染后14d。
　　4．rTsNd對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的免疫治療效果及其

21、機(jī)制
　　PBS對(duì)照組小鼠在DSS處理后第4天出現(xiàn)腸炎跡象，第5天出現(xiàn)體重下降；而rTsNd免疫小鼠的腸炎體征不明顯，其體重也得到較好的控制。誘導(dǎo)腸炎第10天，解剖小鼠發(fā)現(xiàn)PBS對(duì)照組小鼠的結(jié)腸明顯變薄、變短，結(jié)腸切片H&E染色發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織中出現(xiàn)了大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、潰瘍、水腫、杯狀細(xì)胞的喪失及正常腸結(jié)構(gòu)的破壞，而rTsNd免疫組小鼠則未出現(xiàn)這種典型的炎癥表現(xiàn)。結(jié)腸冰凍切片IFT結(jié)果顯示，rTsNd免疫小鼠能夠抑制結(jié)腸炎性組織中中

22、性粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。rTsNd免疫后小鼠血清IgG1明顯高于IgG2a（P<0.01），IgE抗體濃度也明顯升高，表明rTsNd免疫可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答。應(yīng)用夾心ELISA對(duì)細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果表明，rTsNd與巨噬細(xì)胞共孵育后可抑制巨噬細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生；rTsNd免疫接種能促進(jìn)小鼠產(chǎn)生IL-4（P<0.05），但可抑制IFN-γ與IL-17的產(chǎn)生；提示rTsNd對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的免疫預(yù)防效果可能與rTsNd抑制炎性

23、細(xì)胞浸潤(rùn)及抑制Th1與Th17應(yīng)答有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1．本研究構(gòu)建了pMAL-c2X-TsNd重組表達(dá)質(zhì)粒，并成功克隆表達(dá)了rTsNd。發(fā)現(xiàn)TsNd在旋毛蟲(chóng)的各個(gè)發(fā)育時(shí)期中均有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，主要定位于蟲(chóng)體的表皮、生殖原基及生殖器官部位。
　　2．rTsNd具有良好的抗原性、免疫原性及Nudix水解酶活性，能與宿主的腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合，rTsNd免疫小鼠對(duì)旋毛蟲(chóng)攻擊感染具有部分免疫保護(hù)作用。
　　3．rTsN