旋毛蟲(chóng)水孔蛋白基因的克隆、表達(dá)及鑒定.pdf

1、旋毛蟲(chóng)病(Trichinellosis)是由旋毛蟲(chóng)(Trichinella spp.)感染引起的一種食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病，呈世界性分布，可感染包括人類在內(nèi)的150余種動(dòng)物，嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致宿主死亡，并給畜牧業(yè)發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。水孔蛋白是廣泛存在于生物體內(nèi)的水通道蛋白，屬于主要內(nèi)在膜蛋白家族(Major Intrinsic Protein)，可作為潛在的抗寄生蟲(chóng)藥物靶點(diǎn)和疫苗抗原候選分子。
　　本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)旋

2、毛蟲(chóng)水孔蛋白基因EST序列設(shè)計(jì)特異性引物，先用通用引物PR1將旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板用特異性引物克隆得到旋毛蟲(chóng)水孔蛋白基因(TsAQP)的完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列。生物信息學(xué)分析表明TsAQP基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?67 bp，可編碼288個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為31.01 kDa，理論等電點(diǎn)為8.47。TsAQP含有5個(gè)環(huán)(A-E)，B、E環(huán)具有保守的NPA(Asn-

3、Pro-Ala)模體結(jié)構(gòu)。TsAQP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占34.38％，β-轉(zhuǎn)角占9.38%，其余為伸展鏈和無(wú)規(guī)卷曲。TsAQP與人AQP9氨基酸序列一致性為45.0%，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示TsAQP屬于水-甘油水孔蛋白亞家族。將TsAQP基因121-151、78-97(B環(huán))、210-238(E環(huán))和262-288序列連接到pGEX4T-1原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別得到大小為29.3、28.1、29.3

4、、29.0 kDa的重組蛋白。人工合成TsAQP基因的非跨膜區(qū)序列TsAQPnt，并構(gòu)建pET-30a-TsAQPnt重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
　　結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白大小為25.2 kDa，主要以包涵體形式存在，能夠被旋毛蟲(chóng)感染豬血清識(shí)別；qRT-PCR結(jié)果表明TsAQP基因在旋毛蟲(chóng)新生幼蟲(chóng)、3日齡成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)中均有表達(dá)，但在新生幼蟲(chóng)時(shí)期表達(dá)水平相對(duì)較高。組織定位結(jié)果顯示，TsA