P49抗原基因及Caenorhabditis elegans homologus基因在旋毛蟲中的研究.pdf

1、旋毛蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲，寄生于人體可導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。為了了解我國幾個不同地區(qū)旋毛蟲之間的種屬關(guān)系，我們對這些地區(qū)的旋毛蟲進(jìn)行了線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞單位I(COI)基因的擴(kuò)增，并得到了正確的COI基因。利用ClusterX、Genedoc等軟件我們對這些COI基因序列進(jìn)行了分析，構(gòu)建了遺傳距離矩陣及系統(tǒng)發(fā)生樹。分析可知，T1與東北株COI基因的相似性高達(dá)97.9％，遺傳距離僅為0.0081，兩者的同源性非常高。T2與T5株CO

2、I基因的相似性為95.0％，遺傳距離為0.0412，同源性也很高，兩者與T3株有一定的差別。湖北株與云南株的遺傳距離為0.0000，兩者的同源性最高。而河南株與其它幾種的差異均比較大，這是由什么原因造成的有待研究。因此COI基因可作為鑒定旋毛蟲親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的有效工具。 以旋毛蟲基因組DNA為模板，我們擴(kuò)增與C.eleganslin-28基因同源的片段，將序列與C.eleganslin-28的部分序列在Genedoc軟件中進(jìn)行比對

3、和分析，同源性達(dá)到93％以上，說明旋毛蟲中存在lin-28同源基因。因此，我們利用原位雜交技術(shù)研究了lin-28及與其相關(guān)的3個異時性基因在旋毛蟲中的分布情況。在胚胎、5日成蟲體內(nèi)都檢測到lin-28mRNA的存在，在早期胚胎中均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，隨著胚胎發(fā)育和細(xì)胞數(shù)目的增多而減少，在成蟲期分布于蟲體的頭部及咽部。let—7mRNA在早期胚胎中的分布與lin-28mRNA的分布類似，但在中晚期逐漸分布于胚胎四周至幼蟲形成期仍有微量表達(dá)，

4、在成蟲中主要分布于頭咽部和尾部。lin—4mRNA主要在胚胎早中期均勻分布，晚期則多見于四周，成蟲僅見于頭咽部。lin—14mRNA在胚胎內(nèi)分布與lin-28mRNA相同，成蟲中也多位于頭咽部，10日成蟲尾部也有分布。此外，let—7mRNA及l(fā)in—4mRNA分別在肌肉幼蟲蟲體2/5處也有分布。 為了解旋毛蟲排泄分泌抗原中P49抗原的功能，我們對旋毛蟲的P49抗原基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)鑒定。我們利用3’RACE法對旋毛蟲P49抗

5、原基因的cDNA進(jìn)行了擴(kuò)增，獲得的cDNA片段大小為1100bp。進(jìn)行了P49抗原基因的cDNA克隆和篩選，獲得的陽性質(zhì)粒進(jìn)行了酶切驗證和測序。將序列正確的重組質(zhì)粒酶切后利用融合表達(dá)載體pGEX構(gòu)建了P49重組表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。利用IPTG(1mmol/L)進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，運(yùn)用SDS—PAGE凝膠電泳對表達(dá)結(jié)果進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)重組P49融合蛋白分子量大小約為60KDa。并進(jìn)行了重組蛋白的純化和免疫獲得了相應(yīng)的

6、抗體。利用westernblot分析了該蛋白在不同發(fā)育時期的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)P49在旋毛蟲的成蟲和肌肉幼蟲中均有表達(dá)，且肌肉幼蟲中較多。此外，通過構(gòu)建p49—L4440質(zhì)粒，我們對C.elegans進(jìn)行了RNAi，發(fā)現(xiàn)P49RNAi后C.elegans壽命明顯縮短。 為了更好的了解旋毛蟲的基因組信息及篩選控制旋毛蟲的靶基因，我們以旋毛蟲EST庫及C.elegans基因組信息為依據(jù)設(shè)計了一系列引物進(jìn)行3’RACEPCR擴(kuò)增，得到了3