免疫蛋白組學(xué)對(duì)旋毛蟲診斷抗原的篩選與鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、旋毛蟲病(trichinellosis)主要因生食或半生食含有旋毛蟲（Trichinella）幼蟲的豬肉或其它動(dòng)物肉類而感染，是一種呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病。由于旋毛蟲病無(wú)特異性的癥狀和體征，因此，臨床上對(duì)本病不易進(jìn)行及時(shí)、正確的診斷。目前，該病的確診主要依靠肌肉活檢和高特異性的免疫學(xué)診斷方法，但前者取決于肌肉樣本的大小及感染程度，對(duì)于輕度和早期感染者往往不易檢出，即使感染晚期因取材局限陽(yáng)性率也只有50％左右，且不易被患者接

2、受。在旋毛蟲感染的過(guò)程中，幼蟲的排泄分泌(excretory-secretory，ES)蛋白主要來(lái)自于桿狀體分泌顆粒，直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶抗原，可刺激宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，被國(guó)際旋毛蟲病委員會(huì)(International Conference on Trichinellosis，ICT)推薦用于ELISA或Westernblotting檢測(cè)血清中的旋毛蟲抗體，但在旋毛蟲感染早期抗體檢出率較低，且與其

3、他寄生蟲感染者之間存在一定的交叉反應(yīng)。本研究對(duì)旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白進(jìn)行雙向電泳(two dimensional gel electrophoresis，2-DE)、Western blotting和質(zhì)譜分析，并對(duì)篩選出的旋毛蟲保護(hù)性抗體靶向抗原(antigen targeted by protectiveantibodies，ATPA，GenBank No.gi|404638)基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及免疫學(xué)鑒定，并將其用于旋毛蟲實(shí)驗(yàn)感染小

4、鼠和旋毛蟲病人血清特異性抗體的檢測(cè)，對(duì)尋找旋毛蟲病免疫診斷候選抗原及研制高保護(hù)性旋毛蟲病疫苗具有一定的科學(xué)意義。
　　材料與方法:
　　1旋毛蟲蟲種、血清與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　本文所用蟲種為河南省南陽(yáng)豬源旋毛蟲(T1)由本實(shí)驗(yàn)室傳代保種。檢測(cè)血清包括鄉(xiāng)土旋毛蟲(T2)、布氏旋毛蟲(T3)、偽旋毛蟲(T4)、納氏旋毛蟲(T7)、裂頭蚴、弓形蟲與日本血吸蟲感染小鼠血清，以及旋毛蟲病人與其他寄生蟲病人血清。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明小鼠和雌性

5、BALB/c小鼠。
　　2應(yīng)用免疫蛋白組學(xué)篩選旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白中的早期診斷抗原
　　通過(guò)人工消化法和改良貝氏法收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲，于體外培養(yǎng)后獲得其ES蛋白。將旋毛蟲肌幼蟲經(jīng)灌胃法感染BALB/c小鼠(300條/只)，在感染后14～42天隔天進(jìn)行尾靜脈采血，分離血清，應(yīng)用肌幼蟲ES蛋白分別通過(guò)ELISA和Western blotting對(duì)感染小鼠血清中的旋毛蟲抗體進(jìn)行檢測(cè)，將感染后最早出現(xiàn)旋毛蟲抗體的血清用于后續(xù)

6、實(shí)驗(yàn)。將旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白進(jìn)行2-DE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，通過(guò)Western blotting應(yīng)用旋毛蟲感染早期抗體陽(yáng)性血清對(duì)旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白進(jìn)行識(shí)別，將陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
　　3旋毛蟲ATPA基因的克隆、表達(dá)及鑒定
　　將旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白中分子量為30～40 kDa、通過(guò)質(zhì)譜被成功鑒定的陽(yáng)性反應(yīng)蛋白點(diǎn)在2-DE凝膠和膠片上的灰度值及其比值分別進(jìn)行比較，從中選出比值最大的ATPA作為研究對(duì)象，應(yīng)用基因工

7、程技術(shù)對(duì)旋毛蟲ATPA基因進(jìn)行分子克隆、表達(dá)和純化，將純化后的rATPA蛋白免疫BALB/c小鼠獲得其免疫血清，通過(guò)Western blotting分析其抗原性和免疫原性，應(yīng)用RT-PCR觀察ATPA基因在旋毛蟲不同發(fā)育期（成蟲、新生幼蟲、成囊前期幼蟲及成囊期幼蟲）是否轉(zhuǎn)錄;應(yīng)用間接免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFT)對(duì)ATPA蛋白在旋毛蟲不同發(fā)育期的表達(dá)及其在蟲體組織的定位進(jìn)行分析。
　　4 rATPA用于旋毛蟲感染小鼠與旋毛蟲病人血清抗

8、體的檢測(cè)
　　應(yīng)用rATPA蛋白與肌幼蟲ES蛋白分別建立檢測(cè)旋毛蟲抗體IgG的rATPA-ELISA與ES-ELISA方法，分別用于檢測(cè)旋毛蟲(T1、T2、T3、T4和T7)感染小鼠及其他寄生蟲感染小鼠、旋毛蟲病人及其他寄生蟲病人血清抗體觀察rATPA-ELISA診斷旋毛蟲病的敏感性與特異性。將30只雌性6周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為重度(500條/只)、中度(300條/只)、輕度(100條/只)3個(gè)感染組（每組10只），應(yīng)用rA

9、TPA-ELISA與ES-ELISA同時(shí)對(duì)3組小鼠感染后2～42天的血清抗體進(jìn)行檢測(cè)，觀察rATPA-ELISA對(duì)旋毛蟲感染早期及輕度感染的診斷價(jià)值。5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用卡方檢驗(yàn)和重復(fù)資料的方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水平為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1應(yīng)用免疫蛋白組學(xué)篩選旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白中的早期診斷抗原
　　應(yīng)用ELISA及Western blotting

10、方法在小鼠感染旋毛蟲后18天可檢測(cè)出血清抗旋毛蟲抗體。分別將200μg和800μg旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白經(jīng)10％和12％凝膠進(jìn)行2-DE，可將分子量為40～60 kDa和30～40 kDa的蛋白進(jìn)行很好的分離，分別檢測(cè)到約33個(gè)和150個(gè)蛋白點(diǎn)，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后應(yīng)用旋毛蟲感染后18天的小鼠血清進(jìn)行Western blotting分析，發(fā)現(xiàn)有31個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)蛋白點(diǎn)，分別經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS分析，共鑒定出7種旋毛蟲

11、蛋白，分別為:2種絲氨酸蛋白酶[serine proteases，SP1.2（到168805931）和SP1.3(gi|13641204，gi|168805933)]、DNaseⅡ(gi|339241449，gi|316974621)、2種假定的胰蛋白酶(putative trypsin，gi|339241891和gi|339241897)、保護(hù)性抗體靶向抗原(ATPA，gi|404638)及保守的假定蛋白(conserved hypo

12、thetical protein，gi|316966524)。對(duì)成功鑒定的已知功能的7種旋毛蟲蛋白進(jìn)行功能分類，7種旋毛蟲蛋白均具有催化和水解活性，且與代謝過(guò)程有關(guān)。
　　2 ATPA基因的克隆、表達(dá)及鑒定
　　通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)ATPA基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其不含跨膜區(qū)，但含有信號(hào)肽序列（切割位點(diǎn)位于17～18位氨基酸殘基間），且具有良好的抗原性。通過(guò)RT-PCR獲得ATPA基因，并將其連接至表達(dá)載體pMAL-c2X，成功構(gòu)

13、建了ATPA基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-ATPA。對(duì)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-ATPA進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在74 kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白帶（載體蛋白43 kDa+目的蛋白31 kDa)，表明重組蛋白表達(dá)成功，可溶性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白以可溶與包涵體2種形式表達(dá)。應(yīng)用Amylose樹脂預(yù)裝柱對(duì)表達(dá)的rATPA進(jìn)行純化，將純化后的rATPA蛋白免疫BALB/c小鼠獲得免疫血清，ELISA檢測(cè)rATPA免疫血

14、清的效價(jià)為1∶106。Western blotting結(jié)果顯示，rATPA可被旋毛蟲感染小鼠血清及rATPA免疫血清識(shí)別，rATPA免疫血清均可識(shí)別旋毛蟲肌幼蟲可溶性蛋白和ES蛋白的天然ATPA。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，ATPA基因在旋毛蟲4個(gè)發(fā)育期（成蟲、新生幼蟲、成囊前期幼蟲和成囊期幼蟲）均有轉(zhuǎn)錄;IFT結(jié)果顯示，ATPA蛋白在以上4個(gè)發(fā)育期均有表達(dá)，且主要定位于蟲體表皮與桿狀體部位。
　　3 rATPA用于旋毛蟲感染小鼠血清抗

15、體的檢測(cè)
　　應(yīng)用rATPA-ELISA檢測(cè)T1、T2、T3、T4和T7感染小鼠的血清抗體陽(yáng)性率分別為96.67％(29/30)、90.00％(27/30)、93.33％(14/15)、40.91％(9/22)和93.75％(15/16)，應(yīng)用ES-ELISA法檢測(cè)T1、T2、T3、T4和T7感染小鼠的血清抗體，分別為100％(30/30)、100％(30/30)、100％(15/15)、90.91％(20/22)和100％(16

16、/16);統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測(cè)T1、T2、T3和T7感染小鼠血清抗體陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），但在檢測(cè)T4感染小鼠血清時(shí)，rATPA-ELISA的陽(yáng)性率低于ES-ELISA(P＜0.05)。
　　應(yīng)用rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測(cè)旋毛形線蟲感染小鼠血清的抗體陽(yáng)性率分別為96.67％(29/30)和100％(30/30)(P＞0.05)，檢測(cè)裂頭蚴感染小鼠血清的抗體

17、陽(yáng)性率分別為16.13％(5/31)和3.22％(1/31)(P＞0.05)，檢測(cè)日本血吸蟲感染小鼠血清的抗體陽(yáng)性率分別為68.75％(11/16)和6.25％(1/16)(P＜0.05)。rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測(cè)弓形蟲感染小鼠血清及正常小鼠血清均為陰性。
　　4rATPA-ELISA檢測(cè)不同劑量旋毛蟲感染小鼠后不同時(shí)間的血清抗體水平
　　在重、中、輕度旋毛蟲感染小鼠，rATPA-ELISA首次檢測(cè)到旋毛

18、蟲抗體的時(shí)間分別是感染后8、12及14天，ES-ELISA首次檢測(cè)到旋毛蟲抗體的時(shí)間分別是感染后10、8及10天。在旋毛蟲重度感染組，感染后12天和14天，rATPA-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為20％和40％，ES-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為80％和100％(P＜0.05);在旋毛蟲中度感染組，感染后10、12和14天，rATPA-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為0、20％和30％，ES-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為70

19、％、100％和100％(P＜0.05);在旋毛蟲輕度感染組，感染后12～24天隔天（感染后12、14、16、18、20、22和24天），rATPA-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為0、10％、10％、10％、30％、30％和30％，ES-ELISA檢測(cè)的抗體陽(yáng)性率分別為10％、60％、80％、80％、80％、100％和100％(P＜0.05)。在輕、中、重度旋毛蟲感染小鼠，rATPA-ELISA檢測(cè)到旋毛蟲抗體100％的時(shí)間分別是在感染

20、后30、22及28天，ES-ELISA檢測(cè)到旋毛蟲抗體100％的時(shí)間分別為感染后22、12及14天。結(jié)果表明，在旋毛蟲重、中及輕度感染組，在感染后16、16及26天，rATPA-ELISA與ES-ELISA檢測(cè)的血清抗體陽(yáng)性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　rATPA-ELISA檢測(cè)重、中、輕度感染小鼠血清抗體水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.049，P＞0.05)，感染后不同時(shí)間的抗體水平之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2

21、19.924，P＜0.05)，感染后檢測(cè)時(shí)間與感染劑量之間存在交互關(guān)系(F=3.311，P＜0.05);兩兩比較結(jié)果顯示，感染后10～16天及24～28天血清抗體水平均呈升高趨勢(shì)(P＜0.05)。ES-ELISA檢測(cè)重、中、輕度感染小鼠血清抗體水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.901，P＜0.05)，感染后不同時(shí)間的抗體水平之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=478.276，P＜0.05)，感染后檢測(cè)時(shí)間和感染劑量之間存在交互關(guān)系(F=5.71

22、0，P＜0.05);兩兩比較結(jié)果顯示感染后8～32天血清抗體水平均呈升高趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　5 rATPA用于旋毛蟲病人血清抗體的檢測(cè)
　　rATPA-ELISA和ES-ELISA檢測(cè)旋毛蟲病人血清抗體陽(yáng)性率均為100％(22/22)，rATPA-ELISA僅在日本血吸蟲病人血清檢測(cè)到1例抗體陽(yáng)性(5.00％)，而檢測(cè)并殖吸蟲病人、華支睪吸蟲病人、棘球蚴病人、豬囊尾蚴病人、裂頭蚴病人及健康人血清抗體均為陰性。rATP

23、A-ELISA檢測(cè)旋毛蟲病人血清抗體的敏感性與特異性分別為100％與99.13％。ES-ELISA檢測(cè)日本血吸蟲病人、并殖吸蟲病人、華支睪吸蟲病人、棘球蚴病人、豬囊尾蚴病人、裂頭蚴病人抗體抗體陽(yáng)性率分別為20.00％(4/20)、5.00％(1/20)、14.29％(1/7)、25.00％(5/20)、25.00％(5/20)和12.50％(1/8)，而檢測(cè)健康人血清抗體為陰性。rATPA-ELISA和ES-ELISA檢測(cè)日本血吸蟲病人

24、、并殖吸蟲病人、華支睪吸蟲病人和裂頭蚴病人血清的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），而在檢測(cè)棘球蚴病人和豬囊尾蚴病人血清時(shí)，rATPA-ELISA優(yōu)于ES-ELISA(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用2-DE與質(zhì)譜分析從旋毛蟲肌幼蟲ES蛋白中鑒定出了7種旋毛蟲蛋白（2種絲氨酸蛋白酶、DNaseⅡ、2種胰蛋白酶、保護(hù)性抗體靶向抗原及保守的假定蛋白），均具有催化和水解活性，這7種蛋白對(duì)旋毛蟲病可能具有潛在的早期診斷價(jià)值。