旋毛蟲Nudix水解酶DNA疫苗構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫保護(hù).pdf

1、旋毛蟲病是一種幾乎呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病，主要因生食或半生食含旋毛蟲幼蟲的豬肉而感染。目前對旋毛蟲病尚無有效的預(yù)防疫苗和控制方法。因此，世界各國每年投入大量人力、物力及財力用于動物肉類中旋毛蟲的檢疫與獸用疫苗的研究，希望阻斷旋毛蟲病由動物向人類的傳播。
　　近年來，感染性疾病的預(yù)防性DNA疫苗和腫瘤的治療性DNA疫苗的研究發(fā)展很快。DNA疫苗在接種后，其免疫和病毒的自然感染過程相似，促進(jìn)黏膜免疫的發(fā)生，誘導(dǎo)免疫記憶反

2、應(yīng)，以及交叉保護(hù)反應(yīng)，外源的目的基因可以在體內(nèi)不斷表達(dá)蛋白，刺激免疫系統(tǒng)，所以 DNA疫苗可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相對持久的免疫反應(yīng)。
　　旋毛蟲對宿主小腸上皮細(xì)胞的附著、侵入是其致病的關(guān)鍵，但其侵入機(jī)制目前尚不清楚。目前推測旋毛蟲對小腸上皮細(xì)胞的侵入可能是通過幼蟲的某些分泌性蛋白（即侵入相關(guān)因子）所介導(dǎo)的。本課題組前期通過旋毛蟲腸道感染性幼蟲與肌幼蟲的抑制消減雜交cDNA文庫，篩選出了一種分子量為46 kDa且具有水解酶活性的旋毛蟲Nud

3、ix水解酶（TsNd），本論文采用減毒沙門氏菌介導(dǎo)TsNd基因進(jìn)入小鼠體內(nèi)表達(dá)，重組質(zhì)粒通過真核表達(dá)載體進(jìn)行攜帶，盡最大程度保證TsNd基因表達(dá)的蛋白與天然蛋白有相似性。以口服方式使TsNd重組沙門氏菌進(jìn)入體內(nèi)，之后侵入腸道黏膜淋巴組織，目的基因就可以在抗原遞呈細(xì)胞中表達(dá)。TsNd重組菌免疫過程與旋毛蟲天然感染階段相似，含整個腸道階段均同時以腸道為入侵起點。此外，本文還應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建TsNd基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒（即TsNd DN

4、A肌肉注射疫苗），接種動物后觀察其在體內(nèi)的表達(dá)及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與免疫保護(hù)效果。
　　材料與方法:
　　1.旋毛蟲蟲種，載體，菌株，實驗動物及細(xì)胞系
　　旋毛蟲（T1）由本教研室昆明小鼠傳代保種。pc DNA3.1+載體質(zhì)粒，大腸埃希菌（E.coli）JM109，由本實驗室凍存保存。雌性4周齡 BALB/c小鼠購自河南省實驗動物中心。所用細(xì)胞系為乳倉鼠腎細(xì)胞BHK-21，來自河南省疾控中心細(xì)胞資源中心。鼠傷寒沙門氏菌⊿

5、cyaSL1344株由河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院動物疫病與公共安全重點實驗室惠贈。
　　2 TsNd的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　應(yīng)用生物信息學(xué)與ORF Finder在線預(yù)測工具分析TsNd基因的ORF，TsNd基因從第111位到1358位，總長1248bp，編碼415個氨基酸。設(shè)計并合成PCR引物，擴(kuò)增出 TsNd基因片段，將其插入到載體 pcDNA3.1中構(gòu)成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TsNd,對其進(jìn)行酶切以及測序鑒定正

6、確后，將部分電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌中，另一部分轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中保存。
　　3重組沙門氏菌的構(gòu)建及其在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)
　　在核酸水平，將TsNd基因電轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌液進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增后得到與理論值大小相符的 TsNd基因條帶，說明重組沙門氏菌⊿cya SL1344/pcDNA3.1-TsNd構(gòu)建成功；其次對重組菌的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，初次免疫后7d提取小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)RNA進(jìn)行RT-PCR，同時在蛋白

7、水平利用免疫熒光試驗（IFA）檢測TsNd在脾臟內(nèi)的表達(dá)情況。
　　4 TsNd重組質(zhì)粒的鑒定
　　應(yīng)用改良貝氏法收集感染后35d的旋毛蟲肌幼蟲；提取旋毛蟲總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR反應(yīng)獲得1248bp的TsNd基因，將TsNd基因克隆到pMD19-T載體，通過BamHI和XhoI雙酶切及單酶切，用特異性引物進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆插入TsNd基因片段大小的正確性。然后將TsNd基因亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1

8、，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TsNd。序列測定證實插入片段的正確性。此外，通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，應(yīng)用IFA檢測TsNd在 BHK-21細(xì)胞的表達(dá)。
　　5 TsNd DNA疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答
　　對兩種途徑免疫的小鼠尾靜脈采血，ELISA檢測抗TsNd抗體IgG，IgG1及IgG2a。收集免疫小鼠的腸道沖洗液檢測腸道分泌型 IgA，收集脾細(xì)胞檢測細(xì)胞因子 IFN-γ，IL-2，IL-4及 IL-10。

9、經(jīng)口免疫組通過 IFA檢測腸道沖洗液中特異性 IgA對旋毛蟲不同發(fā)育期蟲體的識別，而質(zhì)粒肌肉注射組則通過 IFA檢測免疫血清IgG對旋毛蟲不同期蟲體的識別。
　　6 TsNd DNA疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫保護(hù)
　　將240只小鼠BALB/c隨機(jī)分為6組（每組40只）：分別對DNA疫苗口服組與肌肉注射組、空菌與空質(zhì)粒對照組，兩個 PBS組分別口服與肌肉注射接種免疫4次，每次免疫間隔2周；末次免疫后7d，每只小鼠經(jīng)口攻擊感染30

10、0條旋毛蟲肌幼蟲。攻擊感染后7d與35d天分別剖殺小鼠，收集旋毛蟲成蟲與肌幼蟲，觀察腸道期成蟲與肌幼蟲數(shù)，計算其減蟲率。
　　結(jié)果:
　　1.通過BamHI和XhoI酶切，PCR鑒定及測序結(jié)果證實,成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TsNd。
　　2. RT-PCR結(jié)果顯示TsNd基因在免疫小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄；IFA結(jié)果表明TsNd基因在免疫小鼠的脾臟和腸系膜淋巴結(jié)均有表達(dá)。
　　3.重組

11、質(zhì)粒pcDNA3.1-TsNd轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后，IFA檢測發(fā)現(xiàn)TsNd基因在BHK-21細(xì)胞中表達(dá);Western blot分析表明在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)的TsNd蛋白可被旋毛蟲感染血清以及TsNd重組蛋白免疫血清所識別。
　　4.血清抗體檢測結(jié)果表明，DNA疫苗口服與肌肉注射組的特異性IgG水平均是在第2次和第3次免疫后明顯升高，并在末次免疫后1周達(dá)到峰值，而在對照組及PBS空白對照組則無明顯改變。在初次免疫后的第4周和

12、第6周，血清中的IgG1水平明顯高于IgG2a水平，IgG2a水平在第2次免疫后及攻擊感染前均有非常明顯增高，表明DNA疫苗口服或肌肉注射免疫小鼠均誘導(dǎo)產(chǎn)生了以Th2型免疫反應(yīng)為主的Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)。
　　5. DNA疫苗口服與肌肉注射組小鼠腸道總IgA及特異性IgA水平與免疫前相比均有明顯升高；IFA結(jié)果表明免疫小鼠的腸道分泌型 IgA與血清 IgG均可識別旋毛蟲不同期蟲體。細(xì)胞因子檢測顯示， DNA疫苗口服與肌肉注

13、射組的IFN-γ，IL-2, IL-4及IL-10均明顯高于對照組（P<0.05），且免疫后4種細(xì)胞因子水平持續(xù)升高，口服與肌肉注射組均在初次免疫后第8周達(dá)到峰值，表明DNA疫苗口服與肌肉注射均誘導(dǎo)了Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)。
　　6. TsNd DNA疫苗口服免疫組的成蟲減蟲率（73.32％）和肌幼蟲減蟲率（49.5%）明顯高于空菌對照組（Fadults=54.049, Flarvae=15.066, P<0.05)；肌肉注

14、射免疫組的成蟲減蟲率（40.44%）和肌幼蟲減蟲率（53.9%）亦明顯高于空質(zhì)粒照組（Fadults=43.265, Flarvae=14.598, P<0.05）。結(jié)果表明TsNd DNA疫苗口服與肌肉注射免疫小鼠均可誘導(dǎo)部分免疫保護(hù)作用，口服組的成蟲減蟲率高于肌肉注射組（χ2=22.54，P<0.01），但2種免疫途徑的肌幼蟲減蟲率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.406，P>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了重組