旋毛蟲mif基因與mcd-1基因的DNA免疫保護作用以及泛素共表達對DNA免疫影響.pdf

1、旋毛蟲?。═richinellosis）是由旋毛蟲（Trichinella spiralis）引起的一種危害嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病，是肉類食品安全性的一個重要指標。在旋毛蟲的長期寄生生活中，分泌了大量具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白，對宿主免疫系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)，以逃避宿主免疫應(yīng)答。這些分子除了其免疫調(diào)節(jié)功能外，還是潛在的疫苗候選分子，將它們應(yīng)用于疫苗研究中將具有重要意義。泛素(Ubiquitin，Ub)是一個由76個氨基酸殘基組成的小蛋白，普遍

2、存在于真核細胞中且序列高度保守。泛素依賴性的蛋白質(zhì)降解途徑是目前已知的重要的、有高度選擇性的蛋白降解途徑之一。泛素化可對DNA疫苗的免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響。本研究克隆了2個具有免疫調(diào)節(jié)功能的旋毛蟲分泌蛋白基因——旋毛蟲巨噬細胞移動抑制因子（Tsmif）和旋毛蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子（Tsmcd-1），構(gòu)建了pVAX1真核表達載體的DNA疫苗，在BALB/c小鼠體內(nèi)對DNA免疫保護作用進行了研究。結(jié)果顯示，Tsmif和Tsmcd-1的共表達能夠

3、誘導特異性體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答，并對旋毛蟲感染產(chǎn)生部分的免疫保護。此外，與小鼠泛素的共表達增強了細胞免疫應(yīng)答，并促進了pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫產(chǎn)生的抗感染保護能力。
　　 根據(jù)GenBank中發(fā)表的旋毛蟲mif基因（Tsmif）序列(AY050661)和旋毛蟲mcd-1基因（Tsmcd-1）序列(DQ777102)，設(shè)計引物。以旋毛蟲成蟲總RNA為模板，RT-PCR擴增出大小2個TsMIF基因片段Tsmi

4、f和Tsmif"，1個TsMCD-1基因片段Tsmcd-1。構(gòu)建了3個重組質(zhì)粒pVAX1-Tsmif、 pVAX1-Tsmcd-1和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1;雙酶切鑒定結(jié)果顯示，陽性質(zhì)粒分別切出3000 bp的pVAX1.0質(zhì)粒片段和大小相符的靶基因片段，即:345 bp（Tsmif）、1221 bp（Tsmcd-1）和1602 bp（Tsmif-Tsmcd-1）。序列分析結(jié)果顯示，擴增的Tsmif和Tsmif"基因片段與

5、GenBank中已公布序列(AY050661)的核苷酸同源性和氨基酸同源性均為99.7％;擴增的Tsmcd-1基因片段與GenBank中已公布序列(DQ777102)的核苷酸同源性為99％，氨基酸同源性為100％。
　　 以pET28(b)為載體，構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pET28(b)-Tsmif、pET28(b)-Tsmcd-1和pET28(b)-Tsmif-Tsmcd-1，分別在BL21大腸桿菌中表達。SDS-PAGE表明，重

6、組蛋白rTsMIF表達于上清中，而重組蛋白rTsMCD-1與rTsMIF-TsMCD-1則主要以包涵體的形式存在。Western blot分析結(jié)果顯示3種重組蛋白均能與感染旋毛蟲的小鼠血清反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶（16.5 kDa、50 kDa和63 kDa）。重組蛋白經(jīng)純化后，分別與弗氏佐劑乳化皮下注射免疫BALB/c小鼠，制備了以上3種重組蛋白的小鼠抗血清。為了檢測TsMIF與TsMCD-1的特異性抗體，以重組蛋白rTsMIF-TsMCD

7、-1作為抗原建立了間接ELISA(rTsMIF-TsMCD-1-ELISA);經(jīng)方陣試驗確定抗原包被濃度為2.3μg/ml，血清檢測稀釋度為1∶128，抗原與抗體的最佳反應(yīng)時間為90 min。
　　 為了研究Tsmif和Tsmcd-1的DNA疫苗免疫效果，將三種重組質(zhì)粒pVAX1-TsmifpVAX1-Tsmcd-1和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1分別用肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠，以PBS和pVAX1分別為空白對

8、照和空載體質(zhì)粒對照;每組20只BALB/c小鼠，共免疫2次，間隔2周。二免后14d，進行攻蟲保護試驗。經(jīng)口感染旋毛蟲感染性幼蟲(L1)35 d后，剖殺所有小鼠分別計算肌肉荷蟲量(LPG)。目的基因在小鼠體內(nèi)的表達分別用RT-PCR和Western blot進行鑒定。結(jié)果顯示，目的基因均在肌肉注射部位獲得了表達，pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫產(chǎn)生了TsMIF和TsMCD-1的共表達蛋白。在首免后0、10、20、28d采集免疫小

9、鼠血清，用重組蛋白rTsMIF-TsMCD-1包被的間接ELISA對免疫小鼠的特異性抗體水平的動態(tài)變化進行了分析，結(jié)果顯示，pVAX1-Tsmif免疫沒有產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答;而pVAX1-Tsmcd-1和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫分別誘導了特異性IgG、 IgM和IgA的產(chǎn)生，但沒有檢測到特異性IgE抗體。與pVAX1-Tsmcd-1相比，pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫引起了較低的抗體應(yīng)答(P＜0.05)。I

10、gG亞型分析顯示，lgG2a和IgG2b的抗體滴度顯著高于IgG1，表現(xiàn)為Th1型抗體占優(yōu)勢的體液免疫應(yīng)答。此外，對血清細胞因子含量的動態(tài)變化的分析結(jié)果顯示，三種重組質(zhì)粒的DNA免疫均產(chǎn)生了一定水平的Th1型細胞因子(IFN-γ)，但未檢測到Th2型細胞因子(IL-4、IL-5);低水平的TGF-β1可能與抑制優(yōu)勢細胞因子（IFN-γ）有關(guān);各組均未能檢測到IL-17，暗示沒有炎癥反應(yīng)的發(fā)生。二免后14 d，用流式細胞分析儀分析了免疫小

11、鼠外周血淋巴細胞中CD4+T細胞和CD8+T細胞的數(shù)量，結(jié)果顯示，3個重組質(zhì)粒免疫組的CD4+T細胞數(shù)量顯著高于對照組(P＜0.05)，特別是pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫組(P＜0.01);而pVAX1-Tsmif和pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫組的CD8+T細胞的數(shù)量也顯著高于對照組（P＜0.05），pVAX1-Tsmcd-1免疫組則與對照無差異（P＞0.05）;3個重組質(zhì)粒免疫的CD4+/CD8+值均高于對

12、照組，說明重組質(zhì)粒免疫均促進了小鼠T淋巴細胞的增殖。攻蟲保護試驗結(jié)果顯示，單獨的pVAX1-Tsmif和pVAX1-Tsmcd-1免疫均未能獲得LPG的減少，而pVAX1-Tsmif-Tsmcd-1免疫組的LPG則顯著低于對照組（P＜0.05），獲得了23.17％的肌幼蟲減蟲率，表現(xiàn)出部分的免疫保護性。
　　 為了研究靶抗原泛素化對DNA免疫的影響，我們用RT-PCR克隆了小鼠泛素基因（Ub），并構(gòu)建了與Ub共表達的重組質(zhì)粒pV

13、AX1-Ub-Tsmif、 pVAX1-Ub-Tsmcd-1和pVAX1-Ub-Tsmif-Tsmcd-1。將以上重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK細胞，Western blot沒有檢測到與重組蛋白TsMIF-TsMCD-1抗血清反應(yīng)的目的條帶，但加入蛋白酶體抑制因子MG-132后，分別檢測到了大約22 kDa、57 kDa和68 kDa的條帶，其大小與預(yù)測的泛素化蛋白Ub-TsMIF、Ub-TsMCD-1和Ub-TsMIF-TsMCD-1的大小相

14、符。體外轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果顯示，Ub共表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細胞后，表達了靶蛋白（TsMIF、TsMCD-1或TsMIF-TsMCD-1）的泛素化蛋白;泛素化促進了靶蛋白在BHK細胞內(nèi)的降解，而MG-132可以抑制這種降解作用。隨后，將Ub共表達重組質(zhì)粒分別用肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠，以PBS和pVAX1、pVAX1-Ub分別為空白對照和空載體質(zhì)粒對照、泛素免疫對照。通過檢測特異性抗體應(yīng)答、血清細胞因子水平和外周血CD4+T細胞和C