旋毛蟲侵入宿主腸上皮細胞差異microRNA篩選及其與靶基因的作用關系.pdf

1、背景與目的
　　旋毛蟲病是一種呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病，主要因生食或半生食含有旋毛蟲幼蟲囊包的豬肉及其它肉制品所致。目前，旋毛蟲病在俄羅斯及東歐國家、墨西哥、智利、阿根廷和泰國等地仍嚴重流行。我國云南、西藏、四川、廣西、湖北、河南、山西、北京、遼寧、吉林、黑龍江等地先后爆發(fā)數(shù)百起旋毛蟲病，估計目前全國感染人數(shù)超過2000萬。人感染旋毛蟲后可能出現(xiàn)的癥狀主要有惡心，嘔吐，乏力，低熱，腹痛，腹瀉或便秘等，嚴重患者可伴有持續(xù)

2、性高熱，眼瞼和面部水腫，全身性肌痛，心肌炎，肺炎或腦炎等。
　　microRNA（miRNA）是一類長約19~24 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的特異性結(jié)合，可導致其降解或翻譯抑制。miRNA在多種寄生蟲不同發(fā)育時期的表達具有特異性，如血吸蟲的sja-miR-1、sja-miR-7-5p與幼蟲性成熟有關，sja-miR-36-3p與童蟲的初期發(fā)育相關；分析顯示一些miRNA還參與了與發(fā)病機理相關的信號通路，如廣州管圓

3、線蟲的 miR-146a-5p、miR-132a-3p可能參與了廣州管圓線蟲感染引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的相關基因調(diào)控?，F(xiàn)今與旋毛蟲相關的miRNA研究較少，且主要關注生理狀態(tài)下與旋毛蟲的發(fā)育及成熟相關的miRNA，而與致病相關的關鍵miRNA尚罕見報道。
　　本研究擬采用 Solexa高通量測序技術篩選旋毛蟲侵入宿主腸上皮細胞后差異表達的 miRNA，并通過生物信息學分析對目標 miRNA可能作用的靶基因進針對以上實驗設計，本課題擬

4、進行如下研究：（1）從旋毛蟲肌幼蟲和腸道感染性幼蟲中提取RNA并進行高通量測序，real time PCR對測序結(jié)果進行驗證。（2）選取目標miRNA，通過RNAhybrid、TargetScan等軟件預測其可能的靶基因，并通過雙熒光素酶報告基因技術驗證目標miRNA與其可能靶基因的作用關系，real time PCR檢測目標miRNA與其靶基因在侵襲前后的表達情況，為揭示miRNA及其靶基因在旋毛蟲侵入宿主腸上皮細胞中的調(diào)控作用提供依

5、據(jù)。
　　方法
　　1采用人工消化法收集旋毛蟲肌幼蟲，并用激活的肌幼蟲與人回盲腸癌細胞HCT-8共孵育后收集旋毛蟲腸道感染性幼蟲，提取兩組樣品的蟲體RNA用于高通量測序，real time PCR檢測隨機選取的部分miRNA的表達情況，以驗證測序結(jié)果。
　　2選取目標miRNA，通過RNAhybrid、TargetScan、MiRanda、PicTar等預測其可能的靶基因，合成野生型與突變型基因片段并連接PGL3-CM

6、V-LUC-MCS載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，與miRNA mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，檢測報告基因表達情況，從而驗證目標miRNA與其靶基因的作用關系。并采用 real time PCR定量檢測目標miRNA及其靶基因在侵襲前后的蟲體中的表達水平。
　　結(jié)果
　　1高通量測序結(jié)果顯示，旋毛蟲幼蟲侵襲宿主腸上皮細胞后，有3431個保守的miRNAs發(fā)生差異表達，其中1466個miRNAs表達上調(diào)，1965個miRNAs表達下

7、調(diào)。此外還預測到78個新的 miRNAs。從測序結(jié)果中隨機選取了18個miRNAs，采用real time PCR檢測其表達水平，結(jié)果與測序數(shù)據(jù)一致。
　　2綜合分析其表達情況、基因序列、生物學活性預測、調(diào)控靶基因的相關功能、以及miRNA與其靶基因結(jié)合的最小自由能（MFE），本研究選定Tsp-let-7及其4個可能的靶基因（Tsp_06966，Tsp_07700，Tsp_07369，Tsp_14768），采用雙熒光素酶報告基因技

8、術檢測報告基因的表達情況，結(jié)果顯示 Tsp_06966， Tsp_07700是Tsp-let-7調(diào)控的潛在靶基因。另通過real time PCR檢測發(fā)現(xiàn)在腸道感染性幼蟲中Tsp-let-7表達水平明顯降低，而Tsp_06966，Tsp_07700表達升高，提示Tsp-let-7可能通過負向調(diào)控Tsp_06966，Tsp_07700的表達，從而參與旋毛蟲侵襲宿主腸上皮細胞的病理過程。
　　結(jié)論
　　1旋毛蟲侵襲宿主腸上皮細胞