旋毛蟲(chóng)侵入宿主腸上皮細(xì)胞差異microRNA篩選及其與靶基因的作用關(guān)系.pdf

1、背景與目的
　　旋毛蟲(chóng)病是一種呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病，主要因生食或半生食含有旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)囊包的豬肉及其它肉制品所致。目前，旋毛蟲(chóng)病在俄羅斯及東歐國(guó)家、墨西哥、智利、阿根廷和泰國(guó)等地仍嚴(yán)重流行。我國(guó)云南、西藏、四川、廣西、湖北、河南、山西、北京、遼寧、吉林、黑龍江等地先后爆發(fā)數(shù)百起旋毛蟲(chóng)病，估計(jì)目前全國(guó)感染人數(shù)超過(guò)2000萬(wàn)。人感染旋毛蟲(chóng)后可能出現(xiàn)的癥狀主要有惡心，嘔吐，乏力，低熱，腹痛，腹瀉或便秘等，嚴(yán)重患者可伴有持續(xù)

2、性高熱，眼瞼和面部水腫，全身性肌痛，心肌炎，肺炎或腦炎等。
　　microRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)約19~24 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的特異性結(jié)合，可導(dǎo)致其降解或翻譯抑制。miRNA在多種寄生蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)具有特異性，如血吸蟲(chóng)的sja-miR-1、sja-miR-7-5p與幼蟲(chóng)性成熟有關(guān)，sja-miR-36-3p與童蟲(chóng)的初期發(fā)育相關(guān)；分析顯示一些miRNA還參與了與發(fā)病機(jī)理相關(guān)的信號(hào)通路，如廣州管圓

3、線蟲(chóng)的 miR-146a-5p、miR-132a-3p可能參與了廣州管圓線蟲(chóng)感染引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的相關(guān)基因調(diào)控。現(xiàn)今與旋毛蟲(chóng)相關(guān)的miRNA研究較少，且主要關(guān)注生理狀態(tài)下與旋毛蟲(chóng)的發(fā)育及成熟相關(guān)的miRNA，而與致病相關(guān)的關(guān)鍵miRNA尚罕見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究擬采用 Solexa高通量測(cè)序技術(shù)篩選旋毛蟲(chóng)侵入宿主腸上皮細(xì)胞后差異表達(dá)的 miRNA，并通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)目標(biāo) miRNA可能作用的靶基因進(jìn)針對(duì)以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本課題擬

4、進(jìn)行如下研究：（1）從旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)和腸道感染性幼蟲(chóng)中提取RNA并進(jìn)行高通量測(cè)序，real time PCR對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。（2）選取目標(biāo)miRNA，通過(guò)RNAhybrid、TargetScan等軟件預(yù)測(cè)其可能的靶基因，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證目標(biāo)miRNA與其可能靶基因的作用關(guān)系，real time PCR檢測(cè)目標(biāo)miRNA與其靶基因在侵襲前后的表達(dá)情況，為揭示miRNA及其靶基因在旋毛蟲(chóng)侵入宿主腸上皮細(xì)胞中的調(diào)控作用提供依

5、據(jù)。
　　方法
　　1采用人工消化法收集旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，并用激活的肌幼蟲(chóng)與人回盲腸癌細(xì)胞HCT-8共孵育后收集旋毛蟲(chóng)腸道感染性幼蟲(chóng)，提取兩組樣品的蟲(chóng)體RNA用于高通量測(cè)序，real time PCR檢測(cè)隨機(jī)選取的部分miRNA的表達(dá)情況，以驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。
　　2選取目標(biāo)miRNA，通過(guò)RNAhybrid、TargetScan、MiRanda、PicTar等預(yù)測(cè)其可能的靶基因，合成野生型與突變型基因片段并連接PGL3-CM

6、V-LUC-MCS載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，與miRNA mimics共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)情況，從而驗(yàn)證目標(biāo)miRNA與其靶基因的作用關(guān)系。并采用 real time PCR定量檢測(cè)目標(biāo)miRNA及其靶基因在侵襲前后的蟲(chóng)體中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1高通量測(cè)序結(jié)果顯示，旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)侵襲宿主腸上皮細(xì)胞后，有3431個(gè)保守的miRNAs發(fā)生差異表達(dá)，其中1466個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，1965個(gè)miRNAs表達(dá)下

7、調(diào)。此外還預(yù)測(cè)到78個(gè)新的 miRNAs。從測(cè)序結(jié)果中隨機(jī)選取了18個(gè)miRNAs，采用real time PCR檢測(cè)其表達(dá)水平，結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)一致。
　　2綜合分析其表達(dá)情況、基因序列、生物學(xué)活性預(yù)測(cè)、調(diào)控靶基因的相關(guān)功能、以及miRNA與其靶基因結(jié)合的最小自由能（MFE），本研究選定Tsp-let-7及其4個(gè)可能的靶基因（Tsp_06966，Tsp_07700，Tsp_07369，Tsp_14768），采用雙熒光素酶報(bào)告基因技

8、術(shù)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示 Tsp_06966， Tsp_07700是Tsp-let-7調(diào)控的潛在靶基因。另通過(guò)real time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在腸道感染性幼蟲(chóng)中Tsp-let-7表達(dá)水平明顯降低，而Tsp_06966，Tsp_07700表達(dá)升高，提示Tsp-let-7可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控Tsp_06966，Tsp_07700的表達(dá)，從而參與旋毛蟲(chóng)侵襲宿主腸上皮細(xì)胞的病理過(guò)程。
　　結(jié)論
　　1旋毛蟲(chóng)侵襲宿主腸上皮細(xì)胞