P2X7受體在旋毛蟲感染小鼠腸型期的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、旋毛蟲病（trichinellosis）是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患寄生蟲病。宿主由于生食或者半生食含有旋毛蟲幼蟲的豬肉或者其它動(dòng)物肉類而感染。腸粘膜是旋毛蟲侵入宿主的門戶，是機(jī)體抗感染的第一道防線和重要屏障，宿主腸粘膜的免疫應(yīng)答決定了旋毛蟲和宿主相互作用以及旋毛蟲在體內(nèi)的生長(zhǎng)和繁殖。因此，宿主腸道的免疫反應(yīng)對(duì)旋毛蟲在宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育和致病起著至關(guān)重要的作用。
　　P2X7受體（purinergic receptor，P

2、2X7R）是P2家族中研究最多的受體之一，在很多免疫性疾病中起著重要的作用。P2X7R表達(dá)于多種免疫細(xì)胞表面，其中單核-巨噬細(xì)胞表面表達(dá)水平最高。P2X7R被三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）激活后形成離子膜孔通道，通過改變胞內(nèi)離子環(huán)境激活下游相關(guān)信號(hào)途徑，活化炎癥小體進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的合成和分泌。而IL-1β是旋毛蟲感染腸道固有免疫的重要組成部分，是清除病原體的最主要效應(yīng)分子之一。

3、很多胞內(nèi)病原體如結(jié)核分枝桿菌、衣原體、利什曼原蟲和弓形蟲等都可以通過破壞P2X7R途徑逃避宿主的免疫殺傷效應(yīng)，表明P2X7R作為一種啟動(dòng)機(jī)體免疫防御作用的觸發(fā)受體，在感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用。
　　在旋毛蟲感染的腸型期（感染后第7天），成蟲以腸絨毛為食、幼蟲對(duì)腸壁組織的頻繁入侵引起腸組織的損傷壞死，壞死細(xì)胞向胞外釋放大量ATP。已有研究表明，高濃度的ATP作為一種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)分子可活化P2X7R。但在旋毛蟲感染中，P2X7R

4、通過介導(dǎo)何種免疫細(xì)胞發(fā)揮的免疫效應(yīng)及其機(jī)制尚有待深入研究。巨噬細(xì)胞是表達(dá)P2X7R的最主要細(xì)胞，同時(shí)也是最早參與腸道炎癥反應(yīng)的固有免疫細(xì)胞。在旋毛蟲感染小鼠的腸粘膜固有層和腹腔中可見大量巨噬細(xì)胞的遷移和活化，證實(shí)了巨噬細(xì)胞在旋毛蟲感染腸型期的炎癥反應(yīng)中不可或缺的地位，但 P2X7R是否介導(dǎo)巨噬細(xì)胞功能在旋毛蟲感染中發(fā)揮免疫防御作用尚不清楚。
　　基于以上研究資料，本課題首先檢測(cè)P2X7R在旋毛蟲感染小鼠腸型期小腸組織、脾臟和腸系膜

5、淋巴結(jié)（mesenteric lymph node，MLN）中的表達(dá)水平，并觀察阻斷P2X7R后對(duì)感染小鼠體內(nèi)蟲荷及巨噬細(xì)胞的影響，以期明確P2X7R在旋毛蟲感染腸型期中的免疫學(xué)作用；為進(jìn)一步闡明P2X7R的作用機(jī)制，觀察了體外旋毛蟲抗原對(duì)巨噬細(xì)胞功能和信號(hào)通路的影響，為初步闡明旋毛蟲感染腸型期的免疫機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為旋毛蟲病的防治和相關(guān)的腸道感染性、炎癥性疾病的治療提供理論依據(jù)和潛在的作用靶點(diǎn)。
　　本課題的主要研究?jī)?nèi)容如下：

6、
　　一、P2X7R在旋毛蟲感染小鼠腸型期的表達(dá)及其作用
　　目的：觀察旋毛蟲感染小鼠腸型期P2X7R的表達(dá)水平及其作用。
　　方法：選取7-8周齡16-18 g的雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組（n=15）：正常對(duì)照組，感染組（每鼠300條旋毛蟲幼蟲灌胃），亮藍(lán)G（brilliant blue G,BBG)+感染組（BBG為P2X7R拮抗劑，按每鼠50mg/kg/d劑量在感染前1天進(jìn)行小鼠腹腔注射，連續(xù)注射7天）。

7、觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)程度等一般情況，并每天記錄小鼠體重變化。在感染后第7天（腸型期）剖殺小鼠，眼眶采血，頸椎脫臼處死，無菌PBS沖洗腹腔收集腹腔灌洗液和腹腔巨噬細(xì)胞，無菌取脾臟、MLN和小腸組織，Western blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小腸組織、脾臟和 MLN中 P2X7R的蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟和MLN中P2X7R+、CD11b+以及CD11b+P2X7R+細(xì)胞比例；ELISA檢測(cè)了血清、腹腔灌洗液及細(xì)胞培養(yǎng)上清中I

8、L-1β和IL-18的分泌情況。為了明確P2X7R在旋毛蟲感染中的作用，觀察阻斷P2X7R后對(duì)感染小鼠體內(nèi)蟲荷（成蟲數(shù)和每克肌肉的幼蟲數(shù)）的影響，并檢測(cè)和比較了上述免疫學(xué)指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，旋毛蟲感染組小鼠小腸組織、脾臟和MLN中P2X7R蛋白表達(dá)水平均明顯升高。脾細(xì)胞以及MLN細(xì)胞中P2X7R表達(dá)比例高達(dá)95％以上，CD11b+單核細(xì)胞的比例升高，且P2X7R的平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，MLN中CD11b+P2X7

9、R+細(xì)胞比例增高。此外，腸道固有層可見大量CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)伴隨P2X7R的高表達(dá)。感染小鼠體內(nèi)IL-1β和IL-18的水平增高，尤其是小腸固有層IL-1β的水平顯著增高。阻斷 P2X7R后，感染小鼠表現(xiàn)為活動(dòng)力明顯下降、腹背弓起、聳毛等癥狀，鏡下小腸黏膜的病理?yè)p害加重，體內(nèi)的成蟲數(shù)和每克肌幼蟲數(shù)要明顯高于感染組；小腸組織中CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少，腸道組織中、外周血和腹腔灌洗液中IL-1β和IL-18的水平明顯降低。

10、r>　　結(jié)論：旋毛蟲感染腸型期小鼠體內(nèi)P2X7R表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的合成和分泌，參與感染急性期小腸組織的免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮清除病原體的作用。
　　二、P2X7R介導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)揮殺蟲效應(yīng)的免疫學(xué)機(jī)制
　　目的：通過體外實(shí)驗(yàn)揭示P2X7R介導(dǎo)巨噬細(xì)胞殺傷旋毛蟲的免疫學(xué)作用機(jī)制。
　　方法：收集正常組和感染組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)P2X7R、NLRP3、P

11、ro-caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)水平。體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系U937或加佛波醇肉豆蔻乙酸酯（Phorbol myristate acetate,PMA）使之活化為巨噬細(xì)胞（PMA-U937）后，與LPS或旋毛蟲成蟲或幼蟲抗原共培養(yǎng)24 h，加入ATP反應(yīng)30min，Western blot法檢測(cè)U937細(xì)胞中炎癥小體NLRP3活化水平。并在相同細(xì)胞培養(yǎng)條件下，在ATP加入前阻斷P2X7R（向培養(yǎng)基中加入10μM

12、A740003孵育2 h），觀察其對(duì)胞內(nèi)NLRP3活化水平的影響。收集上述不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入20條雌蟲成蟲，在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 h，觀察各組培養(yǎng)上清中雌蟲的活動(dòng)度及其產(chǎn)新生幼蟲的數(shù)量。Real-time PCR檢測(cè) PMA-U937細(xì)胞中 P2X7R、NLRP3、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β的mRNA水平。為探討 ATP-P2X7R通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)揮殺蟲效應(yīng)是否與LPS/TLR4信號(hào)通路相關(guān)

13、聯(lián)，提取正常小鼠和感染小鼠小腸組織總RNA后，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序和信息分析，篩選差異表達(dá)基因，進(jìn)行差異基因表達(dá)模式聚類分析。
　　結(jié)果：與正常小鼠相比，旋毛蟲感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中P2X7R表達(dá)上調(diào)，炎癥小體NLRP3活化，Pro-caspase-1和IL-18的蛋白水平增多。旋毛蟲抗原或者LPS刺激的U937細(xì)胞需要在ATP刺激下方能激活炎癥小體NLRP3；阻斷P2X7R后可抑制ATP對(duì)炎癥小體NLRP3的活化。LPS可以誘導(dǎo)

14、PMA-U937細(xì)胞中NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA水平增高。只有LPS和ATP雙重刺激下的U937細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)旋毛蟲雌性成蟲和新生幼蟲具有明顯的殺傷效應(yīng)。差異基因表達(dá)模式聚類分析結(jié)果表明，在小鼠感染的腸型期，小腸組織的TLR4、NF-κB、Pro-IL-1β、IL-6、IL-10等相關(guān)基因高表達(dá)。
　　結(jié)論：旋毛蟲感染腸型期，活化的P2X7R可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥小體NLRP3的活化，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β和IL-18的合