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文檔簡介
1、旋毛蟲?。╰richinellosis)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患寄生蟲病。宿主由于生食或者半生食含有旋毛蟲幼蟲的豬肉或者其它動物肉類而感染。腸粘膜是旋毛蟲侵入宿主的門戶,是機體抗感染的第一道防線和重要屏障,宿主腸粘膜的免疫應答決定了旋毛蟲和宿主相互作用以及旋毛蟲在體內(nèi)的生長和繁殖。因此,宿主腸道的免疫反應對旋毛蟲在宿主體內(nèi)的生長發(fā)育和致病起著至關(guān)重要的作用。
P2X7受體(purinergic receptor,P
2、2X7R)是P2家族中研究最多的受體之一,在很多免疫性疾病中起著重要的作用。P2X7R表達于多種免疫細胞表面,其中單核-巨噬細胞表面表達水平最高。P2X7R被三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)激活后形成離子膜孔通道,通過改變胞內(nèi)離子環(huán)境激活下游相關(guān)信號途徑,活化炎癥小體進而促進細胞因子IL-1β和IL-18的合成和分泌。而IL-1β是旋毛蟲感染腸道固有免疫的重要組成部分,是清除病原體的最主要效應分子之一。
3、很多胞內(nèi)病原體如結(jié)核分枝桿菌、衣原體、利什曼原蟲和弓形蟲等都可以通過破壞P2X7R途徑逃避宿主的免疫殺傷效應,表明P2X7R作為一種啟動機體免疫防御作用的觸發(fā)受體,在感染性疾病中發(fā)揮著重要的作用。
在旋毛蟲感染的腸型期(感染后第7天),成蟲以腸絨毛為食、幼蟲對腸壁組織的頻繁入侵引起腸組織的損傷壞死,壞死細胞向胞外釋放大量ATP。已有研究表明,高濃度的ATP作為一種內(nèi)源性危險信號分子可活化P2X7R。但在旋毛蟲感染中,P2X7R
4、通過介導何種免疫細胞發(fā)揮的免疫效應及其機制尚有待深入研究。巨噬細胞是表達P2X7R的最主要細胞,同時也是最早參與腸道炎癥反應的固有免疫細胞。在旋毛蟲感染小鼠的腸粘膜固有層和腹腔中可見大量巨噬細胞的遷移和活化,證實了巨噬細胞在旋毛蟲感染腸型期的炎癥反應中不可或缺的地位,但 P2X7R是否介導巨噬細胞功能在旋毛蟲感染中發(fā)揮免疫防御作用尚不清楚。
基于以上研究資料,本課題首先檢測P2X7R在旋毛蟲感染小鼠腸型期小腸組織、脾臟和腸系膜
5、淋巴結(jié)(mesenteric lymph node,MLN)中的表達水平,并觀察阻斷P2X7R后對感染小鼠體內(nèi)蟲荷及巨噬細胞的影響,以期明確P2X7R在旋毛蟲感染腸型期中的免疫學作用;為進一步闡明P2X7R的作用機制,觀察了體外旋毛蟲抗原對巨噬細胞功能和信號通路的影響,為初步闡明旋毛蟲感染腸型期的免疫機制提供實驗依據(jù),為旋毛蟲病的防治和相關(guān)的腸道感染性、炎癥性疾病的治療提供理論依據(jù)和潛在的作用靶點。
本課題的主要研究內(nèi)容如下:
6、
一、P2X7R在旋毛蟲感染小鼠腸型期的表達及其作用
目的:觀察旋毛蟲感染小鼠腸型期P2X7R的表達水平及其作用。
方法:選取7-8周齡16-18 g的雌性BALB/c小鼠,隨機分為3組(n=15):正常對照組,感染組(每鼠300條旋毛蟲幼蟲灌胃),亮藍G(brilliant blue G,BBG)+感染組(BBG為P2X7R拮抗劑,按每鼠50mg/kg/d劑量在感染前1天進行小鼠腹腔注射,連續(xù)注射7天)。
7、觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動程度等一般情況,并每天記錄小鼠體重變化。在感染后第7天(腸型期)剖殺小鼠,眼眶采血,頸椎脫臼處死,無菌PBS沖洗腹腔收集腹腔灌洗液和腹腔巨噬細胞,無菌取脾臟、MLN和小腸組織,Western blot和免疫組織化學法檢測小腸組織、脾臟和 MLN中 P2X7R的蛋白表達水平;流式細胞術(shù)檢測脾臟和MLN中P2X7R+、CD11b+以及CD11b+P2X7R+細胞比例;ELISA檢測了血清、腹腔灌洗液及細胞培養(yǎng)上清中I
8、L-1β和IL-18的分泌情況。為了明確P2X7R在旋毛蟲感染中的作用,觀察阻斷P2X7R后對感染小鼠體內(nèi)蟲荷(成蟲數(shù)和每克肌肉的幼蟲數(shù))的影響,并檢測和比較了上述免疫學指標的變化。
結(jié)果:與正常對照組相比,旋毛蟲感染組小鼠小腸組織、脾臟和MLN中P2X7R蛋白表達水平均明顯升高。脾細胞以及MLN細胞中P2X7R表達比例高達95%以上,CD11b+單核細胞的比例升高,且P2X7R的平均熒光強度增強,MLN中CD11b+P2X7
9、R+細胞比例增高。此外,腸道固有層可見大量CD68+巨噬細胞浸潤,同時伴隨P2X7R的高表達。感染小鼠體內(nèi)IL-1β和IL-18的水平增高,尤其是小腸固有層IL-1β的水平顯著增高。阻斷 P2X7R后,感染小鼠表現(xiàn)為活動力明顯下降、腹背弓起、聳毛等癥狀,鏡下小腸黏膜的病理損害加重,體內(nèi)的成蟲數(shù)和每克肌幼蟲數(shù)要明顯高于感染組;小腸組織中CD68+巨噬細胞的數(shù)量減少,腸道組織中、外周血和腹腔灌洗液中IL-1β和IL-18的水平明顯降低。
10、r> 結(jié)論:旋毛蟲感染腸型期小鼠體內(nèi)P2X7R表達上調(diào),介導巨噬細胞促進細胞因子IL-1β和IL-18的合成和分泌,參與感染急性期小腸組織的免疫反應,進而發(fā)揮清除病原體的作用。
二、P2X7R介導巨噬細胞發(fā)揮殺蟲效應的免疫學機制
目的:通過體外實驗揭示P2X7R介導巨噬細胞殺傷旋毛蟲的免疫學作用機制。
方法:收集正常組和感染組小鼠腹腔巨噬細胞,Western blot法檢測細胞內(nèi)P2X7R、NLRP3、P
11、ro-caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達水平。體外培養(yǎng)人單核細胞系U937或加佛波醇肉豆蔻乙酸酯(Phorbol myristate acetate,PMA)使之活化為巨噬細胞(PMA-U937)后,與LPS或旋毛蟲成蟲或幼蟲抗原共培養(yǎng)24 h,加入ATP反應30min,Western blot法檢測U937細胞中炎癥小體NLRP3活化水平。并在相同細胞培養(yǎng)條件下,在ATP加入前阻斷P2X7R(向培養(yǎng)基中加入10μM
12、A740003孵育2 h),觀察其對胞內(nèi)NLRP3活化水平的影響。收集上述不同處理組的細胞培養(yǎng)上清,每孔加入20條雌蟲成蟲,在CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 h,觀察各組培養(yǎng)上清中雌蟲的活動度及其產(chǎn)新生幼蟲的數(shù)量。Real-time PCR檢測 PMA-U937細胞中 P2X7R、NLRP3、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β的mRNA水平。為探討 ATP-P2X7R通路介導巨噬細胞發(fā)揮殺蟲效應是否與LPS/TLR4信號通路相關(guān)
13、聯(lián),提取正常小鼠和感染小鼠小腸組織總RNA后,進行轉(zhuǎn)錄組高通量測序和信息分析,篩選差異表達基因,進行差異基因表達模式聚類分析。
結(jié)果:與正常小鼠相比,旋毛蟲感染小鼠腹腔巨噬細胞中P2X7R表達上調(diào),炎癥小體NLRP3活化,Pro-caspase-1和IL-18的蛋白水平增多。旋毛蟲抗原或者LPS刺激的U937細胞需要在ATP刺激下方能激活炎癥小體NLRP3;阻斷P2X7R后可抑制ATP對炎癥小體NLRP3的活化。LPS可以誘導
14、PMA-U937細胞中NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA水平增高。只有LPS和ATP雙重刺激下的U937細胞培養(yǎng)上清對旋毛蟲雌性成蟲和新生幼蟲具有明顯的殺傷效應。差異基因表達模式聚類分析結(jié)果表明,在小鼠感染的腸型期,小腸組織的TLR4、NF-κB、Pro-IL-1β、IL-6、IL-10等相關(guān)基因高表達。
結(jié)論:旋毛蟲感染腸型期,活化的P2X7R可介導巨噬細胞內(nèi)炎癥小體NLRP3的活化,進而促進IL-1β和IL-18的合
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