旋毛蟲感染及其ES抗原對小鼠NOD1受體通路影響研究.pdf

1、旋毛蟲病是由旋毛蟲感染宿主引起的一種嚴(yán)重的寄生蟲病。這種感染大多數(shù)情況下是食源性的。宿主被旋毛蟲感染的過程中蟲體可產(chǎn)生各類抗原與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，從而危害宿主健康。天然免疫系統(tǒng)能在第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)識(shí)別并抵抗病原體的入侵。NOD1受體是一種關(guān)鍵的天然免疫受體，在許多細(xì)胞和組織中均存在。一般NOD1受體被病原體激活后可活化下游的效應(yīng)分子RIP2，它的能夠引起caspase-1、NF-κB、MAPKs等信號路徑被激活，誘導(dǎo)TNF-α、 IL-

2、1β和IL-6等炎性因子分泌，進(jìn)而引起多種免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究表明，NOD1受體與許多種病原體感染引起的免疫應(yīng)答相關(guān)，如細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等。而在旋毛蟲感染中關(guān)于NOD1受體的研究未見報(bào)道。所以，本研究應(yīng)用熒光定量PCR、Western blot、ELISA等實(shí)驗(yàn)方法來著重研究旋毛蟲感染對宿主NOD1受體通路的影響，從而探討旋毛蟲感染與宿主免疫系統(tǒng)之間互相作用的機(jī)制。
　　依據(jù)GenBank中登錄的小鼠NOD1、RIP2、NF

3、-κB和GAPDH序列，設(shè)計(jì)并合成引物，建立以上基因的熒光定量PCR檢測方法。在旋毛蟲感染小鼠后0.5d、4d、7d、14d、21d、28d、35d應(yīng)用熒光定量PCR檢測其腹腔巨噬細(xì)胞及小腸、心臟、肺臟、肌肉組織中NOD1、RIP2和NF-κB mRNA表達(dá)水平。應(yīng)用Western blot對腹腔巨噬細(xì)胞中NOD1、RIP2、NF-κB p65、NF-κB p-p65進(jìn)行檢測。應(yīng)用ELISA測定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清和血清中TNF-α

4、、IL-1β和IL-6含量。
　　熒光定量PCR結(jié)果表明，旋毛蟲感染小鼠后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中各目的基因表達(dá)量均呈現(xiàn)雙峰的趨勢，其中NOD1、RIP2和NF-κB mRNA在感染后0.5d和21d、4d和21d、0.5d和21d先后呈現(xiàn)兩個(gè)峰值。在小腸和心臟中，感染不同時(shí)期各目的基因表達(dá)量都有升高，分別于感染后4d和14d達(dá)到峰值。在肺臟中，NOD1 mRNA表達(dá)量僅在感染后7d略增多，而RIP2的mRNA表達(dá)量在各個(gè)感染期均呈現(xiàn)上

5、升趨勢，并于感染后4d到達(dá)峰值。在肌肉中，各目的基因在感染初期變化不明顯，而于感染后21d顯著升高，28d到達(dá)峰值。Western blot結(jié)果表明，在旋毛蟲感染小鼠后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NOD1、RIP2和NF-κB p-p65表達(dá)量均有不同程度的升高，其變化趨勢與熒光定量PCR結(jié)果相似。ELISA結(jié)果顯示，感染旋毛蟲小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠血清中TNF-α、IL-6的含量均顯著升高，而IL-1β的含量幾乎沒有變化。
　　另

6、外，本研究在體外用旋毛蟲肌幼蟲ES抗原作用于健康小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，并應(yīng)用熒光定量PCR對細(xì)胞內(nèi)NOD1、RIP2和NF-κB基因表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測，Western blot對細(xì)胞內(nèi)NOD1、RIP2、NF-κB p65、NF-κB p-p65表達(dá)量進(jìn)行測定，ELISA測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的變化。熒光定量PCR結(jié)果表明，在一定的ES抗原作用濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，細(xì)胞中各目的基因的表達(dá)量均隨作用濃度和時(shí)間的增加而

7、下降。Western blot結(jié)果表明，ES抗原的刺激可以使細(xì)胞內(nèi)NOD1、RIP2和NF-κB p-p65蛋白表達(dá)量增加。ELISA結(jié)果顯示，ES抗原的作用可以使細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌量增多，但I(xiàn)L-1β變化不明顯。
　　以上研究結(jié)果表明，旋毛蟲感染可以引起小鼠NOD1受體的激活，上調(diào)NOD1受體通路中關(guān)鍵分子RIP2和下游分子NF-κB的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的分泌。旋毛蟲肌幼蟲ES抗原可以激活并調(diào)節(jié)小鼠