版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、旋毛蟲排泄分泌抗原(excretory-secretory antigen,ES抗原),是一類由旋毛蟲蟲體分泌排泄而產(chǎn)生,可以進(jìn)入宿主機(jī)體,直接暴露于宿主免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原物質(zhì)??捎糜诩膊≡\斷、疫苗以及免疫機(jī)制等方面的研究。Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)家族具有模式識(shí)別受體的功能,通過識(shí)別病原體的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecular patter
2、ns,PAMPs),也稱為TLRs的配體或激動(dòng)劑,構(gòu)成了機(jī)體抗感染的第一道防線,在固有免疫中起著重要作用。TLRs能識(shí)別多種抗原,如內(nèi)源性的熱休克蛋白,及多種外源性抗原。HSP70是一類最保守的熱休克蛋白,具有較強(qiáng)的免疫原性。
本研究采用體外培養(yǎng)旋毛蟲肌幼蟲方法制備E S抗原,用于免疫小鼠制備單克隆抗體,經(jīng)過三輪篩選篩,得到2株穩(wěn)定分泌抗旋毛蟲肌幼蟲ES抗原抗體的雜交瘤細(xì)胞株,2株細(xì)胞分泌抗體亞型均屬于IgG類。選取其中A
3、11細(xì)胞株制備腹水并純化,純化后腹水效價(jià)為1∶2.1×105,純化后單抗?jié)舛葹?.8mg/ml。Western Blot結(jié)果顯示單抗A11可識(shí)別ES抗原中43、49、53kDa三條蛋白帶。
用 ES抗原免疫家兔制備兔抗ES抗原多抗并純化,純化后血清效價(jià)為1∶1.2×106,純化后多抗血清蛋白濃度為8.8mg/ml。用單克隆抗體作為捕獲抗體,以多抗為檢測(cè)抗體,建立了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。經(jīng)方陣法確定單抗最佳工作濃度為
4、7.6μl/ml(1∶500),多抗?jié)舛葹?.4μl/ml(1∶2000)。該檢測(cè)方法對(duì)常見寄生蟲抗原如日本血吸蟲、弓形蟲、豬鞭蟲、豬囊尾蚴、豬蛔蟲、華枝睪吸蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、前后盤吸蟲均無(wú)交叉反應(yīng)。本方法對(duì)ES抗原最小檢出量為12ng/ml。檢測(cè)肌幼蟲24h培養(yǎng)液上清,5蚴/ml即可檢測(cè)出ES抗原。將蟲體進(jìn)行超聲破碎檢出量為0.25蚴/ml。通過對(duì)感染旋毛蟲小鼠不同時(shí)間血清進(jìn)行檢測(cè),在感染后7d即可檢測(cè)出循環(huán)抗原。
利用
5、制備的單抗A11結(jié)合免疫親和層析法,對(duì)旋毛蟲肌幼蟲ES抗原進(jìn)行提純,之后進(jìn)行SDS-PAGE分析,可見分子量大小約為43、49、53kDa的三條混合蛋白帶,混合蛋白濃度為0.34mg/ml。
根據(jù)GenBank中登錄的TLR2、TLR4序列,設(shè)計(jì)并合成引物,采用RT-PCR方法從小鼠巨噬細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增TOLL樣受體2(mTLR2)和TOLL樣受體4(mTLR4)基因,得到基因全長(zhǎng)CDS,經(jīng)克隆測(cè)序正確后分別構(gòu)建真核表達(dá)
6、質(zhì)粒pcDNA3.1-mTLR2和pcDNA3.1-mTLR4。重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,用RT-PCR與免疫熒光檢測(cè)其表達(dá)及細(xì)胞定位,結(jié)果顯示mTLR2轉(zhuǎn)染后成功表達(dá)并定位于細(xì)胞膜。利用 TLR2激活物pam3csk4和TLR4激活物L(fēng)PS分別刺激轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞后,用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析其下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,結(jié)果經(jīng)刺激后TLR2和TLR4熒光素酶活性顯著高于生理鹽水對(duì)照組,說明表達(dá)的mT
7、LR2和mTLR4具有野生型分子的功能。
分別取三種旋毛蟲抗原:旋毛蟲ES抗原、經(jīng)單抗親和純化得到的43、49、53kDa混合蛋白及原核表達(dá)的旋毛蟲HSP70蛋白,分別加入轉(zhuǎn)染了mTLR2或mTLR4的HEK293T細(xì)胞。結(jié)果顯示:旋毛蟲ES抗原和經(jīng)單抗純化得到的43、49、53kDa混合蛋白都與mTLR2和mTLR4受體直接作用,激活下游NF-κB通路,原核表達(dá)的旋毛蟲HSP70蛋白則僅能激活mTLR2受體的NF-κB通
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 雙抗體夾心elisa檢測(cè)旋毛蟲循環(huán)抗原實(shí)驗(yàn)條件的研究
- 旋毛蟲與偽旋毛蟲肌幼蟲抗原的研究.pdf
- 乙型腦炎病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf
- 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)PRRSV抗原的研究.pdf
- 定量檢測(cè)ProMBP雙抗體夾心ELISA方法的初步建立.pdf
- 旋毛蟲成蟲抗原的研究.pdf
- 檢測(cè)BDV抗原的雙抗體夾心ELISA法的建立與臨床應(yīng)用.pdf
- 定量檢測(cè)HPPCn的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf
- 旋毛蟲、絲蟲
- 旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌抗原單克隆抗體的制備及鑒定.pdf
- 旋毛蟲抗原模擬表位的研究.pdf
- NO對(duì)感染旋毛蟲的沙鼠的作用研究.pdf
- 旋毛蟲感染及其ES抗原對(duì)小鼠NOD1受體通路影響研究.pdf
- 丙型肝炎病毒抗體的雙抗原夾心檢測(cè)方法的初步建立.pdf
- 雙抗原夾心ELISA檢測(cè)丙型肝炎病毒總抗體的初步研究.pdf
- SARS-CoV蛋白質(zhì)的抗體譜及雙抗原夾心ELISA檢測(cè)抗體方法的研究.pdf
- hGH單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法的建立.pdf
- 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)粉塵螨2組變應(yīng)原方法的建立及初步應(yīng)用.pdf
- 抗PEDV單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的建立.pdf
- 抗cetuximab單克隆抗體制備及其雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法的建立
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論