雙抗體夾心ELISA檢測(cè)大豆11S球蛋白方法的建立.pdf

1、大豆粕是應(yīng)用較廣泛的植物飼料蛋白質(zhì)資源，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)40％～50％，由于大豆蛋白中必需氨基酸含量高，組成合理，容易被動(dòng)物吸收和利用等優(yōu)點(diǎn)，大豆已成為現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中最廣泛的飼料原料。但是，大豆中還含有諸如大豆抗原蛋白等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子通過(guò)干擾營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、破壞正常的新陳代謝和引起動(dòng)物不良的生理反應(yīng)等多種方式危害動(dòng)物尤其是幼齡動(dòng)物的生長(zhǎng)和健康。大豆抗原蛋白作為重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，建立簡(jiǎn)單、快速的定性定量檢測(cè)方法成為了國(guó)內(nèi)

2、飼料學(xué)及動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。本論文首先開(kāi)展了大豆11S球蛋白的純化、免疫家兔制備大豆11S球蛋白抗血清，然后以此為基礎(chǔ)建立雙抗體夾心ELISA方法，快速檢測(cè)大豆11S球蛋白。
　　 試驗(yàn)一：大豆11S球蛋白的分離提取、純化和鑒定。通過(guò)溶劑對(duì)比實(shí)驗(yàn)及單因素實(shí)驗(yàn)確定了從豆粕中提取大豆抗原蛋白的最佳提取溶劑及影響提取效果的相關(guān)因素，以Tris-HCL作為提取溶劑，從豆粕中提取大豆抗原蛋白，然后利用響應(yīng)面分析法對(duì)大豆抗原蛋白提取工藝條

3、件進(jìn)行優(yōu)化，建立了實(shí)驗(yàn)因素為提取溫度、提取時(shí)間和料液比與大豆抗原蛋白提取效果的動(dòng)力模型，并對(duì)其交互作用進(jìn)行了分析。采用硫酸銨分級(jí)沉淀和Sepharose CL-6B凝膠層析對(duì)大豆11S球蛋白進(jìn)行純化，采用SDS-PAGE電泳對(duì)大豆球蛋白純度進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：大豆抗原蛋白的理想提取工藝條件為：提取溫度19.15℃，提取時(shí)間1.085 h，料液比（g：ml）1：21.2，在此條件下大豆抗原蛋白和大豆11S球蛋白提取得率分別為34.83％、

4、24.45％，分別較優(yōu)化前Thanh法提取大豆抗原蛋白和大豆11S球蛋白提高了54.59％、76.15％。經(jīng)Sepharose CL-6B凝膠層析純化的大豆11S球蛋白呈單一洗脫峰，SDS-PAGE電泳顯示大豆11S球蛋白純度達(dá)90.1％。這表明通過(guò)該方法可獲得電泳純的大豆11S球蛋白。
　　 試驗(yàn)二：大豆11S球蛋白兔抗血清的制備及其分離純化。以純化的大豆11S球蛋白作為抗原，分別經(jīng)過(guò)背部皮下和腹腔途徑對(duì)家兔進(jìn)行免疫，5周后采

5、集大豆11S球蛋白兔抗血清。采用飽和硫酸銨沉淀和Sephadex G-200凝膠層析對(duì)大豆11S球蛋白抗血清進(jìn)行純化，采用免疫電泳和SDS-PAFE對(duì)其純度進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示5周后可獲得效價(jià)高達(dá)1：32以上的大豆11S球蛋白抗血清，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示經(jīng)Sephadex G-200凝膠層析純化的兔IgG出現(xiàn)兩條帶，分別為其重鏈和輕鏈。這表明通過(guò)上述免疫方法可獲得較高效價(jià)的大豆11S球蛋白抗血清，并且經(jīng)過(guò)Sephadex G-20

6、0凝膠層析純化的大豆11S球蛋白抗血清純度可達(dá)到電泳純。
　　 試驗(yàn)三：大豆11S球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制備。利用HPLC法從Sepharose CL-6B凝膠過(guò)濾后的大豆11S球蛋白中制備純大豆11S球蛋白。在SB-C18色譜柱上，以0.1％三氟乙酸水溶液和0.1％三氟乙酸乙腈溶液為流動(dòng)相，流速為0.8 ml/min，采用梯度洗脫方式，制備了大豆11S球蛋白純品，經(jīng)純度分析表明，所制備的大豆11S球蛋白的純度高達(dá)98％，已基本具備標(biāo)準(zhǔn)品

7、的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 試驗(yàn)四：酶標(biāo)抗體制備及雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立。采用過(guò)碘酸鈉改良法制備酶標(biāo)抗體，并以此為基礎(chǔ)，建立了檢測(cè)豆粕中大豆11S球蛋白的雙抗體夾心ELISA方法。由方陣實(shí)驗(yàn)確定包被抗體為1μg/ml、酶標(biāo)抗體最適稀釋度1：800；由正交實(shí)驗(yàn)確定最佳封閉時(shí)間為0.5 h，抗原及酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時(shí)間為1h，底物液作用最佳反應(yīng)時(shí)間為20 min，靈敏度達(dá)2.5 ng/ml，線性檢測(cè)范圍在2.5 ng/ml～5000n