產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及初步應用.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌易引發(fā)畜禽產(chǎn)氣莢膜梭菌病，此類病的發(fā)病急、死亡率高，給各國畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，且易引起人食物中毒和氣性壞疽，嚴重影響人們身體健康，因此對產(chǎn)氣莢膜梭菌病的快速診斷尤為重要。各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生α毒素，它具有細胞毒性、溶血活性、致死性和皮膚壞死性等特性，因此α毒素是診斷產(chǎn)氣莢膜梭菌病的重要指標，為了對其進行快速、有效檢測，必須建立準確、高效、特異的α毒素檢測技術。
　　本研究以產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素為檢測對象，以抗α毒素

2、單克隆抗體、多克隆抗體為基礎，建立了雙抗體夾心ELISA(Double Antibody Sandwich ELISA，DAS-ELISA)方法，為α毒素定量監(jiān)測、后續(xù)研究提供有效工具和基礎。
　　將α毒素重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序驗證后，摸索IPTG最佳誘導條件，表達出大量包涵體重組α毒素蛋白，經(jīng)Ni-changed Resin鎳柱純化后運用SDS-PAGE、Western Blot驗證，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，運用飽和硫酸銨

3、法純化，并檢測其效價和特異性;免疫BALB/c小鼠，制備單克隆抗體，正辛酸法純化后，鑒定其特異性、反應原性、中和活性等。通過方針滴定試驗選取最佳抗體配對建立DAS-ELISA方法，對方法反應條件進行優(yōu)化。
　　將重組的α毒素蛋白標準品從1500ng/mL起兩倍系列稀釋至0.73ng/mL，檢測后建立標準曲線;并對建立的DAS-ELISA方法進行性能評價。DAS-ELISA方法對α毒素的有效檢測范圍為5.86～375ng/mL，最低

4、檢測限為4.57ng/mL;精密度分析表明批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于10％，說明該方法具有較好的重復性和穩(wěn)定性;回收率測定結果在97.22％～102.85％范圍內(nèi)，表明該方法準確性較高;特異性試驗表明本方法與β毒素、ε毒素等無關蛋白無交叉反應，而與天然α毒素和重組α毒素蛋白有特異性反應，說明本法具有較高的特異性。
　　本方法的初步應用結果顯示，相同培養(yǎng)條件下，A～E型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株的培養(yǎng)上清中，α毒素含量差異較大，A型菌(NC

5、TC8237)中旺毒素含量顯著高于其他菌型;國外檢測試劑盒檢測后可得出α毒素的相同變化趨勢，但是其無法定量檢測;本方法比多抗-多抗雙夾心ELISA有更高的特異性和敏感性;檢測臨床發(fā)病兔子腸內(nèi)容物，結果與兔魏氏梭菌病臨床病理變化典型程度相對應，病變越明顯的兔子，測得的OD值越高。
　　本研究成功制備了高特異性的單克隆抗體，并建立了特異、靈敏、穩(wěn)定的DAS-ELISA方法，可以檢測α毒素外源表達蛋白、培養(yǎng)上清及臨床樣品中的天然毒素，并