雙抗體夾心ELISA檢測(cè)粉塵螨2組變應(yīng)原方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、研究背景:變態(tài)反應(yīng)疾病(過(guò)敏性疾病)被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問(wèn)題，世界各國(guó)變態(tài)反應(yīng)性疾病的總發(fā)病率高達(dá)10-30％，此類疾病包括過(guò)敏性哮喘(哮喘)、過(guò)敏性鼻炎等，是臨床上的常見(jiàn)病、多發(fā)病。近些年來(lái)其發(fā)病率在逐步增高。在引起過(guò)敏性疾病眾多吸入性變應(yīng)原中，塵螨是導(dǎo)致呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的最重要因素。與過(guò)敏性疾病有關(guān)的塵螨主要為屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus，Derp)和粉塵螨(Derma

2、tophagoidesfarinae，Derf)。它們喜好在溫暖、潮濕環(huán)境中繁衍，以人或動(dòng)物的皮屑、指甲及毛發(fā)為主要食物，多藏匿于床褥、枕頭、地毯、衣服、毛絨玩具或家具內(nèi)。塵螨個(gè)體雖小，但生理器官系統(tǒng)俱全，成分非常復(fù)雜，螨體至少含有十幾種變應(yīng)原組分，但最主要的致敏成分是1組和2組變應(yīng)原(Der1、Der2)，且每克灰塵含2μg的主要變應(yīng)原便可使過(guò)敏性體質(zhì)人群致敏，每克灰塵含10μg的主要變應(yīng)原便可使過(guò)敏性體質(zhì)人群發(fā)作過(guò)敏性疾病。其中De

3、r1的分子量為25Kd，屬半胱氨酸蛋白酶，其酶原可使1組變應(yīng)原發(fā)生自我裂解。Der2的分子量為14kD，類似附睪蛋白，其具體的生物功能還不完全清楚，但有報(bào)道稱2組變應(yīng)原含量與1組變應(yīng)原一樣高。由于2組螨變應(yīng)原比1組更耐熱及耐降解，與其它種屬間有更多的交叉反應(yīng)性，所以對(duì)于監(jiān)測(cè)環(huán)境中塵螨的含量從而回避變應(yīng)原預(yù)防塵螨過(guò)敏性疾病的發(fā)生更有實(shí)用價(jià)值。 本研究小組既往調(diào)查發(fā)現(xiàn)空調(diào)過(guò)濾網(wǎng)也是塵螨嗜好的棲居場(chǎng)所之一，且塵螨變應(yīng)原可隨空調(diào)送風(fēng)排入

4、室內(nèi)。調(diào)查結(jié)果顯示廣州、深圳地區(qū)粉塵螨較屋塵螨多，兩者占空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中螨的比例達(dá)80％左右。由于現(xiàn)代建筑的通風(fēng)性能較差，且隨著社會(huì)生活水平的提高，人們?cè)诿芊饪照{(diào)環(huán)境內(nèi)工作、生活和學(xué)習(xí)時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng)，尤其是塵螨過(guò)敏體質(zhì)人群有可能因吸入此環(huán)境中的空氣而引發(fā)過(guò)敏性疾病。目前我國(guó)臨床上對(duì)過(guò)敏性疾病的主要處理措施是對(duì)已有疑似癥狀到醫(yī)院求醫(yī)的病人進(jìn)行確診與治療，而在預(yù)防上迄今未有好的檢測(cè)手段及檢測(cè)方法。盡管國(guó)外已有以酶聯(lián)免疫方法開(kāi)發(fā)的商品化的試劑盒供

5、應(yīng)，但存在價(jià)格昂貴(約五百英磅一盒)，在國(guó)內(nèi)沒(méi)有代理點(diǎn)等等問(wèn)題而未能在我國(guó)廣泛應(yīng)用。而在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)對(duì)于定量檢測(cè)塵螨變應(yīng)原含量方法學(xué)研究的報(bào)道。 研究目的: 1.基于關(guān)于定量檢測(cè)塵螨變應(yīng)原含量方面的研究狀況，在本課題組既往研究基礎(chǔ)上，針對(duì)廣州深圳地區(qū)空調(diào)灰塵優(yōu)勢(shì)螨種粉塵螨，建立檢測(cè)環(huán)境中粉塵螨2組變應(yīng)原Derf2含量的雙抗體夾心ELISA法。 2.將方法應(yīng)用于空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中粉塵螨2組變應(yīng)原Derf2含量的檢測(cè)，進(jìn)一

6、步探討空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中塵螨變應(yīng)原與過(guò)敏性疾病發(fā)生的關(guān)系，對(duì)過(guò)敏人群制定防螨措施做好變應(yīng)原回避提供重要的參考依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容與方法:以終濃度為0.5mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存重組子BL21star/pET24a/Derf2進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到的蛋白經(jīng)Ni-NAT純化后梯度透析復(fù)性。采用塵螨過(guò)敏病人血清進(jìn)行蛋白印跡(Western-Bl

7、otting)檢測(cè)。用純的rDerf2免疫新西蘭兔得到抗Derf2多克隆血清，經(jīng)檢驗(yàn)合格后用飽和硫酸銨(NH4)2SO4進(jìn)行鹽析沉淀，脫鹽后，以70mmol/LPH6.3的PB對(duì)DEAE-SepharoseF.F陰離子交換層析柱(AmershamPharmacia,Sweden)進(jìn)行純化，再用過(guò)碘酸鈉氧化法進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記，此酶標(biāo)抗體為雙抗體夾心法的檢測(cè)抗體。用DMEM培養(yǎng)粉塵螨Ⅱ組變應(yīng)原Derf2單克隆抗體，用Prot

8、einA親和層析柱純化，作為捕獲抗體而建立方法，用棋盤滴定法測(cè)定包被液的最佳濃度及酶結(jié)合物的最佳稀釋度。用建立起的雙抗體夾心法測(cè)定全國(guó)五大城市(廣州、深圳、南昌、上海及北京)2004年8月份(塵螨生長(zhǎng)高峰期)的317臺(tái)家庭空調(diào)(廣州60臺(tái)，深圳84臺(tái)，南昌72臺(tái)，上海55臺(tái)，北京48臺(tái))濾網(wǎng)灰塵中粉塵螨2組變應(yīng)原Derf2的含量。 研究結(jié)果: 1.含有rDerf2的陽(yáng)性克隆菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8h后獲高效表達(dá)。Ni-NAT

9、親和層析純化后，純度達(dá)90％。Western-Blotting結(jié)果表明rDerf2具有良好的IgE結(jié)合活性。 2.免疫成功的兔血清經(jīng)硫酸銨沉淀+DEAESepharoseF.F離子交換層析后，抗Derf2多克隆抗體純度達(dá)90％以上。Derf2單克隆抗體的純度達(dá)95％以上。 3.棋盤滴定法顯示包被用的Derf2單克隆抗體最佳工作濃度為1ug/ml，HRP標(biāo)記的抗Derf2多克隆抗體的最佳稀釋度為1：1000。建立的雙抗體夾

10、心法檢測(cè)極限為2/4ng/ml，與參考標(biāo)準(zhǔn)方法相比，特異性為0.938，敏感性為0.918，準(zhǔn)確性為0.925，χ2檢驗(yàn)得P＞0.05，新建立的雙抗體夾心方法與參考標(biāo)準(zhǔn)方法檢出率無(wú)差別。 4.檢測(cè)2004年8月份全國(guó)五大城市的317臺(tái)家庭空調(diào)(廣州60臺(tái)，深圳84臺(tái)，南昌72臺(tái)，上海55臺(tái)，北京48臺(tái))濾網(wǎng)灰塵中Derf2含量的結(jié)果分別為廣州11.36±3.62μg/g灰塵,深圳8.89±1.76μg/g灰塵,南昌17.16±1

11、0.12μg/g灰塵，上海3.87±0.85μg/g灰塵，北京0.46±0.04μg/g灰塵。廣州、深圳、南昌和上海四個(gè)城市的含量均大于引起塵螨過(guò)敏性疾病致敏的閾值2μg/g灰塵，且廣州和南昌兩城市還大于引發(fā)塵螨過(guò)敏性疾癥狀的閾值10μg/g灰塵。只有北京一個(gè)城市低于2μg/g灰塵。 結(jié)論: 1.塵螨主要變應(yīng)原Derf2獲高效表達(dá)與純化，并具有良好的IgE結(jié)合活性。 2.用已純化的Derf2免疫動(dòng)物，制備出粉塵螨