乙型腦炎病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(JEV)感染所引起的一種危害嚴(yán)重的蟲媒性人畜共患病。該病毒主要經(jīng)過擴(kuò)增宿主豬和媒介昆蟲蚊子進(jìn)行傳播。豬是其主要的擴(kuò)增宿主和傳染源。感染后可引起母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及公豬發(fā)生睪丸炎，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且還嚴(yán)重威脅著人類健康。臨床準(zhǔn)確診斷是有效防控該病的重要途徑。但由于傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法操作復(fù)雜、難度大、周期長，而RT-PCR等分子生物學(xué)方法雖然敏感，但操作技術(shù)要求高、需要特殊儀器設(shè)備、且易出

2、現(xiàn)假陽性，因此，簡便、準(zhǔn)確、快速的抗原檢測方法顯得尤為迫切。
　　 本研究利用乙型腦炎病毒單克隆抗體和多克隆抗體，建立了可用于檢測豬、人和蚊子等多種臨床樣品中乙型腦炎抗原的雙抗體夾心ELISA方法，并制備了試劑盒，為乙型腦炎的臨床快速診斷提供了有效工具。
　　 具體研究內(nèi)容如下：
　　 1.JEV雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法的建立
　　 本研究制備了兔源乙型腦炎病毒多克隆抗體。在此基礎(chǔ)上，以已經(jīng)獲得的

3、JEVE蛋白單克隆抗體作為一抗包被酶標(biāo)板，兔源JEV多克隆抗體作為二抗，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體與二抗反應(yīng)，并通過催化底物顯色以檢測樣品中是否含有JEV抗原。經(jīng)過方陣滴定，確定了一抗的最佳包被濃度為5μg/mL，二抗和辣根標(biāo)記抗體的最佳稀釋度分別為1:10000和1:30000。敏感性試驗(yàn)表明，該方法的敏感性可達(dá)到104PFU/mL，并且該方法不與其它常見的豬流行病病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，對(duì)5份樣品進(jìn)行重復(fù)性檢驗(yàn)的變異系數(shù)分別為7

4、.60%、6.70%、6.70%、7.60%、4.40%，均小于10%，將包被的酶標(biāo)板置于37℃連續(xù)5天，標(biāo)準(zhǔn)陰陽性對(duì)照的OD值均沒有發(fā)生明顯變化。以上結(jié)果說明，本研究所建立的JEV雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
　　 2.JEV雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法的臨床初步應(yīng)用
　　 分別用RT-PCR方法和制備的雙抗體夾心ELISA試劑盒對(duì)60份臨床樣品進(jìn)行檢測(包括16份人腦脊