水貂阿留申病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立與應用.pdf

1、水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease，AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，ADV)感染引起的一種以漿細胞彌漫性增生和持續(xù)性病毒血癥為特征的慢性傳染性疾病。ADV屬于細小病毒科（Parvoviridae）、細小病毒亞科（Parvovirinae）、阿留申病毒屬（Amdovirus）。ADV主要侵害水貂的免疫系統(tǒng)，不僅可導致幼貂大量死亡，還將嚴重影響成年貂的繁殖力與毛皮質(zhì)量，

2、給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失，是危害世界水貂養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。目前該病既無有效的疫苗，也無特異性的治療藥物，主要防控手段是通過檢疫淘汰策略凈化種群。因此，建立一種敏感、特異、穩(wěn)定并且適用于基層樣品大規(guī)模篩查的診斷方法勢在必行。
　　本研究從發(fā)病水貂的肝臟組織內(nèi)分離到一株高致病性ADV，將其命名為ADV-HRB，并完成了該毒株全基因組序列的測定，為ADV的深入研究奠定基礎。通過原核表達系統(tǒng)表達了ADV重組VP2蛋白，以此蛋

3、白作為免疫原制備抗ADV的單克隆抗體(Monoclonal antibody, MAb)和兔源多克隆抗體(Polyclonal antibody, PAb)，建立了檢測ADV抗原的雙抗體夾心ELISA(Double-antibody sandwich ELIS，DAS-ELISA)方法，為基層樣品的大規(guī)模篩查提供技術(shù)支持。具體研究結(jié)果如下:
　　1.ADV的分離與鑒定
　　用PCR方法對黑龍江省內(nèi)的部分水貂養(yǎng)殖場進行抽檢，將

4、陽性貂的部分組織加入PBS后研磨，組織研磨液上清除菌后接入CRFK細胞，盲傳5代，PCR方法可在每代培養(yǎng)物中檢測到病毒，負染后在電鏡下可觀察到病毒粒子，分離毒株感染BALB/c小鼠后，可在心、肝、脾、肺、腎、腸組織及血清中檢測到病毒存在。結(jié)果證明分離獲得的毒株為ADV強毒株，將其命名為ADV-HRB。
　　2.ADV分離株全序列測定
　　設計多對引物，對ADV-HRB分離株的全基因組進行擴增、克隆、測序與分析，得到了完整的基

5、因組序列，全長4810 bp。通過與國內(nèi)外分離株的同源比對發(fā)現(xiàn)與ADV-BJ株的相似性最高，為探究ADV體外復制與致病性的研究提供了基礎。
　　3.ADV重組VP2蛋白的原核表達
　　根據(jù)GenBank上已經(jīng)公布的ADV全序列(JN040434.1)，合成VP2高免疫活性區(qū)基因并連接pET-30a(+)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導，獲得了融合表達的ADV-VP

6、2包涵體蛋白。將帶有His標簽的VP2蛋白通過鎳柱進行純化后，采用緩慢透析法復性，Western Blot分析結(jié)果表明該蛋白可與ADV陽性血清產(chǎn)生良好的免疫反應。
　　4.ADV單克隆抗體與兔源多克隆抗體的制備
　　利用經(jīng)過純化、復性的VP2重組蛋白免疫BALB/c小鼠和新西蘭大白兔。取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選獲得了1株IgG亞型的單抗1G5。單抗與兔多抗血清采用辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法純化后，間接ELISA方法檢測其

7、效價均在105以上，間接免疫熒光試驗(IFA)證明兩種抗體和ADV具有良好的免疫反應。
　　5.ADV抗原表位的鑒定
　　將VP2蛋白截短表達為6段，采用Western Blot的方法確定單抗抗原表位的大致范圍，再利用合成肽的方法對抗原表位進行精確定位。初步確定單抗1G5識別的線性表位區(qū)域為460EEEGWPAASGTHFED474。
　　6.ADV雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立與初步應用
　　以純化的MAb