水貂阿留申病毒分離鑒定及其致病性研究和診斷方法的建立.pdf

1、水貂阿留申?。ˋleutian Disease，AD）是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease virus，AMDV)引起的水貂慢性進行性疾病。水貂感染AMDV后主要癥狀為:采食下降、被毛粗亂、母貂空懷、流產(chǎn)或死胎，公貂出現(xiàn)生殖能力下降，少數(shù)出現(xiàn)急性死亡。該病與水貂病毒性腸炎、水貂犬瘟熱并稱為影響水貂健康的三大疫病，AD給養(yǎng)貂業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，目前，在世界范圍內(nèi)的水貂養(yǎng)殖地區(qū)均可見AD的發(fā)生。多年來世界各地養(yǎng)

2、殖水貂國家的科研機構一直努力開展疫苗研發(fā)工作，但因各種原因，始終未見成效。由于一直沒有有效的預防手段，使得AD得以迅速蔓延，當前控制該病的最有效方法為:定期檢疫、淘汰陽性水貂、逐步凈化種群、建立無疫病養(yǎng)殖場。研究表明，我國貂群的AD血清學陽性率高達80％，因而有針對性的分離、鑒定我國流行毒株，研究病毒基因組進化規(guī)律以及病毒的致病特性，建立健全適合的檢測方法，將有利于我國開展AD的診斷、防治、凈化。本研究主要包括以下4個部分:
　　

3、(1)AMDV的分離鑒定及基因組進化分析
　　采集黑龍江某水貂場經(jīng)對流免疫電泳(counter immune electrophoresis，CIEP)檢測為AD陽性，且臨診癥狀明顯的水貂肝臟、脾臟。組織通過研磨處理后接種貓腎細胞(CRFK)以進行AMDV的分離。利用病毒形態(tài)學及分子生物學手段確認自發(fā)病動物體內(nèi)成功分離到一株AMDV，命名為AMDV-HLJ。提取病毒基因組，PCR方法擴增相應片段，經(jīng)過拼接，獲得了部分NS1基因序列

4、以及全部的VP2基因序列。遺傳進化分析表明，AMDV-HLJ可能與國內(nèi)分離株LN1/LN2株由相同的祖先病毒進化而來。通過對VP2蛋白中和性抗原結構域的研究發(fā)現(xiàn)，AMDV-HLJ株在兩個中和性抗原優(yōu)勢區(qū)的5個位點存在氨基酸突變，但這些突變并未影響病毒的抗原性及致病性。
　　(2)病毒分離株致病性分析
　　將分離的病毒AMDV-HLJ感染健康水貂，通過臨診癥狀、剖檢的眼觀病變、臟器的病理學損傷以及病毒基因組的原位雜交等試驗手段

5、研究AMDV-HLJ株對水貂的致病機制。結果表明，AMDV-HLJ可導致水貂的嚴重發(fā)病，甚至死亡。病毒感染水貂后，其呈現(xiàn)多器官損傷;在組織病理學層面，病毒感染水貂的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)相應器官均可出現(xiàn)典型的病毒感染病變，該結果進一步表明，AMDV的感染可能會誘發(fā)細菌的繼發(fā)感染;組織原位雜交實驗表明，AMDV不僅僅存在于單核-巨噬細胞系統(tǒng)中，在睪丸生精細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞、小腦浦肯野細胞內(nèi)均可檢測到

6、病毒核酸，上述結果均表明，AMDV可在感染機體的多種器官內(nèi)的不同細胞復制，其可能利用多種致病機制損傷被其感染的宿主。
　　(3)水貂阿留申病CIEP檢測方法的建立
　　CIEP作為一種簡便易行的AD血清學檢測方法，一直以來以其準確、高效、成本低等優(yōu)勢作為AD抗體檢測通用手段。但我國AD的CIEP檢測一直以來嚴重依賴進口抗原，國產(chǎn)抗原也是源于進口毒株，其與本地流行毒株抗原性差距較大。本實驗利用AMDV-HLJ分離株進行CIEP

7、抗原制備，優(yōu)化制備流程，在不影響特異性和敏感性的前提下提高產(chǎn)出量。研究表明，基于分離毒株制備的CIEP抗原具有良好的特異性和敏感性，可應用于日常的實驗室或者現(xiàn)地AMDV抗體檢測。
　　(4)可視化環(huán)介導等溫擴增(LAMP)檢測AMDV方法的建立
　　在日常生產(chǎn)中，分子水平的AMDV檢測與血清學檢測手段互為補充。本研究成功建立了簡單、高效、敏感、經(jīng)濟的AMDV LAMP檢測方法。研究表明，利用設計的6條引物能夠有效擴增AMDV

8、基因組，LAMP反應在65℃45min條件下達到擴增產(chǎn)物的最大量值;敏感性試驗表明，LAMP方法比傳統(tǒng)的PCR方法敏感100倍，且檢測結果可直接用肉眼觀察、判定，而不需要其他特殊的儀器裝置。利用該方法對現(xiàn)地樣品的檢測表明其適用于日常AMDV的分子檢測。
　　目前國內(nèi)對于AD及AMDV的研究相對較少，本研究以國內(nèi)流行毒株為研究切入點，分別從病毒進化、致病機制及診斷方法三個層面探討中國AMDV分離株的生物學特性，為我國的AD防控起到積