水貂阿留申病毒VP2蛋白適配體的篩選與初步應用研究.pdf

1、水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease，AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，AMDV)感染引起的自身免疫功能發(fā)生紊亂、衰竭的慢性持續(xù)性傳染病。該病引起幼貂死亡和成年貂貂皮質量和生殖力下降，嚴重影響了水貂養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。針對該病目前沒有商品化疫苗，貂場主要通過定期篩查、檢疫、淘汰陽性個體達到種群的凈化。隨著我國水貂養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，開展水貂的實驗動物化研究迫在眉睫，開展疫病診斷

2、和治療制劑研究前景廣闊。
　　核酸適配體是從體外合成的寡核苷酸文庫中利用指數富集配體系統(tǒng)進化技術(SELEX)篩選得到的單鏈核苷酸分子（RNA或ssDNA），通過折疊形成高級結構，與特定靶標高效結合影響其生物學功能。核酸適配體以高親和力、高特異性、易修飾、可大量合成、化學性質穩(wěn)定等優(yōu)勢，在毒素、腫瘤細胞、致病菌和病毒等診斷技術研究中應用廣泛。因此，核酸適配體作為單克隆抗體的有益補充，可為獸醫(yī)病原微生物研究提供新思路和新工具。

3、>　　本研究采用磁珠SELEX技術篩選了AMDV VP2蛋白的核酸適配體。經過10輪篩選，獲得與靶蛋白具有明顯親和力的富集文庫。通過高通量測序、同源性比對和進化樹分析，共得到4個不同分支，分別選取候選核酸適配體(AMDV-1＃、AMDV-11＃、AMDV-14＃和AMDV-18＃)進行特性分析。ELOSA試驗結果顯示AMDV-1＃和AMDV-14＃與靶蛋白具有良好的親和力(Kd=565nM和Kd=247nM)和特異性(P＜001)。通過

4、比較AMDV-1＃和AMDV-14＃適配體的高級結構發(fā)現，兩者存在共同序列“CCTATGCGTGCTACCGTG”，且該序列參與形成典型的莖環(huán)結構，該結構可能與適配體的特性直接相關。
　　為了開發(fā)核酸適配體在AMDV檢測上的應用價值，本研究建立了核酸適配體和單克隆抗體聯(lián)合應用的雙夾心ELOSA方法。通過優(yōu)化反應條件，確定單克隆抗體的最佳工作濃度為10ng/μL，適配體濃度為1μM，該方法與犬細小病毒、犬腺病毒及BSA蛋白均無交叉反

5、應，檢測限度為50ng/μL，通過檢測53份水貂糞便臨床樣品，該方法與PCR檢測的總符合率為8966％。為了篩選得到具有抑制病毒復制的核酸適配體，本研究首先建立了AMDV-Utah株在CRFK細胞上的感染體系，MTT試驗結果表明不同濃度適配體對細胞活性沒有產生明顯影響(P＞005)。根據富集文庫測序、序列進化分析結果，挑選15條序列開展抗病毒活性研究。結果表明，AMDV-12?？山档透腥倔w系中約22％的病毒載量，而其它適配體對病毒復制的