用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選IBDV弱毒株VP2蛋白CEF受體的初步研究.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接觸性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。IBDV主要侵害雛雞的中樞免疫器官-法氏囊，導(dǎo)致免疫抑制。1957年本病首次在美國的特拉華州的甘布羅鎮(zhèn)(Gumboro)的肉雞群中發(fā)生，20世紀(jì)80年代美國又發(fā)現(xiàn)了變異株，歐洲國家首先報道有超強(qiáng)毒株(vvIBDV)出現(xiàn)，90年代初vvIBDV傳至中國及亞洲其它國家和地區(qū)。IBD給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IBDV的分子生

2、物學(xué)研究始于70年代，人們研究發(fā)現(xiàn)各IBDV毒株之間的基因變異主要集中在A節(jié)段的VP2區(qū)域，VP2是血清型特異性抗原，既是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，又是病毒的主要宿主保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。隨著對IBDV的深入研究，人們愈加認(rèn)識到研究病毒感染機(jī)制等基礎(chǔ)領(lǐng)域的重要性，其中病毒受體的研究占據(jù)著舉足輕重的地位，在很多領(lǐng)域都展開廣泛研究，尤其人醫(yī)方面研究更為深入。目前關(guān)于IBDV受體蛋白研究的報道很少，

3、雖然有一些相關(guān)報道，但仍處于研究病毒自身蛋白與蛋白之間作用的水平，有關(guān)病毒蛋白與宿主受體蛋白相互作用的研究還沒有報到。 酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種有效方法。該系統(tǒng)能迅速、靈敏地在真核細(xì)胞體內(nèi)檢測蛋白生理狀態(tài)下的互作，并可快速獲得目的蛋白的編碼基因，近幾年來己在很多領(lǐng)域得到應(yīng)用。本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)從CEFcDNA文庫中篩選與IBDV弱毒VP2蛋白相互作用的受體蛋白編碼基因，并對獲得受體蛋白進(jìn)行初步研究，為研究

4、該病毒的致病機(jī)制，防制傳染性法氏囊病奠定理論基礎(chǔ)。 本課題主要研究內(nèi)容包括以下幾方面： 1.雞胚成纖維細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建利用gateway技術(shù)構(gòu)建雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)文庫，以5’端生物素標(biāo)記的Oligo(dT)primer為引物反轉(zhuǎn)錄后連接Adapter，層析柱純化，通過BP重組反應(yīng)構(gòu)建cDNA入門文庫，其平均滴度為1.1×106cfu/mL，文庫總?cè)萘繛?.2×107cfu，平均插入片段為2243bp，重組

5、率為100％。通過LR重組反應(yīng)將入門文庫轉(zhuǎn)換為表達(dá)文庫，經(jīng)測定平均滴度為5×105cfu/mL，文庫總?cè)萘繛?.5×106cfu，平均插入片段為2411bp，重組率為100％。結(jié)果表明，所構(gòu)建的文庫具有較高的重組率和較大的庫容量，可作為較高質(zhì)量的文庫來研究IBDV的相關(guān)基因，為篩選IBDV在CEF中的細(xì)胞受體，研究細(xì)胞嗜性提供基礎(chǔ)平臺。 2.IBDV弱毒VP2誘餌載體構(gòu)建及其自激活作用的檢測通過BP和LR兩個反應(yīng)將IBDVGt株

6、VP2基因克隆到pDEST-32載體上構(gòu)建誘餌載體，通過酶切和PCR鑒定。并測序正確后，用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母菌MaV203，在三缺陷板(SC-Trp-Leu-His)上觀察其生長情況。結(jié)果確定了3AT使用濃度，且證明了誘餌載體本身無自激活活性，為下一步篩選文庫提供正確的誘餌載體。 3.從CEF文庫篩選與IBDVGtVP2蛋白相互作用受體蛋白及相互作用的驗證用構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒篩選CEFcDNA文庫，采用順序轉(zhuǎn)化的方法，先將Bait質(zhì)粒

7、轉(zhuǎn)入酵母MaV203中，挑取陽性克隆做酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含Bait質(zhì)粒酵母感受態(tài)細(xì)胞，通過X-gal實驗和三種缺陷型培養(yǎng)基篩選，找出19個陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序并比對，結(jié)果獲得大小兩段序列(與原雞序列相似度為99.9％)，分別為800bp和350bp。最后將兩段序列構(gòu)建成Prey質(zhì)粒，用同篩庫的方法反過來驗證與GtVP2的互作，結(jié)果證實了二者的相互作用。 4.IBDVVP2蛋白CEF受體的初步研究突變掉CR2

8、11中間所含終止密碼子，將其分別克隆到原核載體pET32a和真核表達(dá)載體pCAGGS上。經(jīng)Amp+篩選、PCR、酶切和序列分析鑒定表明，插入的位置、大小和讀碼框均正確。獲得重組質(zhì)粒命名為pET32a-CR211和pCAGGS-CR211。將pET32a-CR211轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)了約31kDa的融合蛋白；將構(gòu)建的pCAGGS-CR211轉(zhuǎn)染IBDV非允許細(xì)胞PK15，做間接免疫熒光實驗，結(jié)果檢測到較