運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白.pdf

1、埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)已知包括五種亞型，其中四種會(huì)導(dǎo)致人類和其它哺乳類發(fā)生嚴(yán)重致死的出血熱疾病，被稱為埃博拉病毒病。該病毒于1976年首次被發(fā)現(xiàn)。2013-2015年，西非爆發(fā)了最新一次的埃博拉病毒疫情，截止到2017年2月，全球已確認(rèn)感染埃博拉病毒28616人，造成11310人死亡，死亡率達(dá)39.5％。人類感染病毒后，病毒可在全身各組織器官中分布，造成多部位出血以及器官壞死，嚴(yán)重者導(dǎo)致患者死亡。由于其感染性強(qiáng)，

2、傳播速度快，致死率高，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列為“第四級(jí)病毒”。EBOV是一種非節(jié)段性的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組大小約19kb，順序?yàn)?’-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’，編碼包膜蛋白(GP)、N蛋白(NP)、L蛋白(L)、病毒蛋白(VP30、VP35)和基質(zhì)蛋白(VP40、VP24)以及非結(jié)構(gòu)蛋白sGP、ssGP等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒蛋白可與多種宿主蛋白相互作用進(jìn)而阻斷干擾素應(yīng)答，抗原呈遞，RN

3、Ai抗病毒應(yīng)答，體液免疫，T細(xì)胞依賴的B細(xì)胞應(yīng)答，細(xì)胞免疫等多種過程。但其具體入侵、復(fù)制及致病致死機(jī)制尚不明確。酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast Two-Hybrid System)是Fields和Song等于1989年首次提出的。該方法運(yùn)用真核生物轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbinding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(DNA transcription activation domain，AD)分別標(biāo)記病毒蛋白和宿主

4、蛋白，當(dāng)二者存在相互作用時(shí)啟動(dòng)下游報(bào)告基因表達(dá)，進(jìn)而篩選出相互作用對。
　　本研究運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)從人肝cDNA文庫中篩選出與埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白，用于研究GP、VP30、NP、L蛋白在埃博拉病毒感染和致病過程中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步解釋埃博拉病毒的致病機(jī)理提供依據(jù)。以本實(shí)驗(yàn)室保存的埃博拉病毒RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用重組PCR技術(shù)構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP3

5、0、pGBKT7-NP、pGBKT7-L。誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細(xì)胞Y2HGOLD中，進(jìn)行毒性檢測以及自活化試驗(yàn)。陽性對照質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，確保酵母雙雜交系統(tǒng)可用。文庫滴度測定，保證人肝cDNA文庫符合酵母雙雜交的滴度要求。將誘餌菌株與人肝 cDNA文庫菌株進(jìn)行雜交，在DDO/X/A篩選平板上初次篩選，然后將篩選到的陽性克隆在QDO/UA篩選平板進(jìn)一步篩選，對篩選到的陽性克隆進(jìn)行DNA測序和生物信息學(xué)分析。利用酵母回復(fù)性

6、實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，排除假陽性結(jié)果。共篩選出6個(gè)可能與GP、VP30、NP、L蛋白有相互作用的宿主蛋白，分別是銅代謝結(jié)構(gòu)域蛋白1(COMMD1)、白蛋白(ALB)、脂蛋白-a-Ⅱ(APOA2)、蛋白酶調(diào)解因子8(PSMD8)、結(jié)合珠蛋白(HP)、細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)。酵母回復(fù)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明了COMMD1和APOA2與NP蛋白可能存在相互作用。通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了6個(gè)可能與埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相