酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與Myosin Ⅹ相互作用的蛋白質(zhì).pdf

1、酵母雙雜交系統(tǒng)是目前研究蛋白質(zhì)相互作用的重要手段之一,此方法具有高靈敏度、相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷及不經(jīng)蛋白純化即可獲得蛋白編碼區(qū)的優(yōu)點(diǎn)。近年來,酵母雙雜交技術(shù)在研究蛋白質(zhì)相互作用、篩選新蛋白、研究蛋白功能等方面發(fā)揮了重要作用。
　　 肌球蛋白X(Myosin X,Myo X)是僅表達(dá)于脊椎動(dòng)物中的非傳統(tǒng)肌球蛋白,其尾部的MYTH4和FERM結(jié)構(gòu)域可與多種功能蛋白相結(jié)合。這些蛋白與絲足的形成、神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)與投射、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、細(xì)胞的

2、粘附及有絲分裂中紡錘體的形成等過程密切相關(guān)。因此Myo X在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用。
　　 為了進(jìn)一步深入的研究Myo X在脊椎動(dòng)物體內(nèi)的作用,本研究利用酵母雙雜交技術(shù),以Myo X的尾部結(jié)構(gòu)域中的MYTH4和FERM結(jié)構(gòu)為誘餌,對(duì)人胎腦cDNA文庫進(jìn)行了篩選。實(shí)驗(yàn)經(jīng)Leu、Trp、His、Ade四種氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選以及β-半乳糖苷酶活性分析,共獲得112個(gè)陽性克隆,經(jīng)過反復(fù)傳代四種氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選和β

3、-半乳糖苷酶活性分析,去除一個(gè)酵母菌株中含有兩個(gè)cDNA文庫質(zhì)粒的可能,再經(jīng)過回交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,最大程度的保證了酵母雙雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。從酵母菌株中提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,以氨芐青霉素(Amp)抗性篩選靶質(zhì)粒,對(duì)部分陽性克隆的插入片段進(jìn)行測(cè)序,在GENE BANK進(jìn)行比對(duì)后分類,從分類結(jié)果可知與Myo X相互作用的蛋白涉及參與細(xì)胞遷移蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、參與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)鞍住⑴c基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等,為深入了解MyoX在生理