酵母雙雜交系統(tǒng)的建立及CLN8P互作蛋白的篩選與初步鑒定.pdf

1、目的：神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(neuronalceroidlipofuscinoses，NCLs)是一組人類進(jìn)行性神經(jīng)元變性疾病，多為常染色體隱性遺傳?；咎卣鳛槿苊阁w內(nèi)蠟樣脂褐質(zhì)沉積。主要分為NCL1～NCL1010型，CLN8為NCL8的致病基因，其功能及其在發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。本研究首先建立酵母雙雜交系統(tǒng)，再應(yīng)用該系統(tǒng)從人胎腦文庫(kù)中篩選CLN8P相互作用蛋白質(zhì)，并對(duì)候選蛋白進(jìn)行初步鑒定分析。通過(guò)對(duì)相互作用蛋白質(zhì)的篩選及研究，

2、探討CLN8的功能，為NCL8和NCLs疾病群的發(fā)病機(jī)制研究提供線索，并為疾病的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)提供資料?！　》椒ǎ?)以SV40大T抗原和P53蛋白的相互作用為陽(yáng)性對(duì)照建立酵母雙雜交系統(tǒng)；2)將CLN8編碼區(qū)序列克隆至MATCHMAKERLexA酵母雙雜交系統(tǒng)pLexA質(zhì)粒，構(gòu)建誘餌(bait)---pLexA-CLN8，再將pLexA-CLN8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母菌株EGY48(p8op-LacZ)，建立EGY48(p8op-LacZ)

3、-pLexA-CLN8融合菌株，檢測(cè)其毒性和自激活性；3)以pLexA-CLN8為誘餌質(zhì)粒，應(yīng)用序列轉(zhuǎn)化法篩選人胎腦cDNA文庫(kù)，得到Leu+LacZ+陽(yáng)性克隆，并用酶切鑒定其外源性片斷；4)應(yīng)用共轉(zhuǎn)化法將獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒一對(duì)一重新轉(zhuǎn)入酵母菌內(nèi)，對(duì)相互作用進(jìn)行驗(yàn)證；5)對(duì)驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆的外源性片斷進(jìn)行測(cè)序及同源性分析。　　結(jié)果：1)建立了酵母雙雜交檢測(cè)系統(tǒng)；2)構(gòu)建了酵母表達(dá)質(zhì)粒pLexA-CLN8及EGY48(p8op-L

4、acZ)-pLexA-CLN8融合菌株，并通過(guò)檢測(cè)證實(shí)CLN8P對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性、無(wú)自激活性；3)以構(gòu)建好的EGY48(p8op-LacZ)-pLexA-CLN8融合菌作“誘餌”，從人胎腦cDNA文庫(kù)中篩選得到60個(gè)Leu+LacZ+陽(yáng)性克隆。提取質(zhì)粒擴(kuò)增后酶切鑒定，獲得有外源性片斷的質(zhì)粒45個(gè)；4)將獲得的具有外源性片段的文庫(kù)質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒一對(duì)一重新轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi)，對(duì)相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，共獲得陽(yáng)性克隆22個(gè)；5)對(duì)驗(yàn)證后陽(yáng)性克隆測(cè)序并進(jìn)行