應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選豬Calsarcin-2蛋白結(jié)合蛋白.pdf

1、Calsarcin（Calcineurin-associated sarcomeric protein，CS）鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶相關(guān)肌原蛋白家族是一個(gè)與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineuria，CaN）結(jié)合的具橫紋肌特異性蛋白質(zhì)新家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的CS家族成員包括Calsarcin-1（CS-1）、Calsarcin-2（CS-2）和Calsarcin-3（CS-3）。在胚胎發(fā)育過程中CS-1和CS-2在心肌和骨骼肌中表達(dá)，但在成人組織中，CS

2、-1在心肌和慢肌纖維中表達(dá)，CS-2僅在骨骼肌快肌纖維中表達(dá)。CS不僅與控制心肌肥大和骨骼肌中慢肌纖維基因表達(dá)的鈣離子依賴的信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)，同時(shí)CS還作為CaN的底物將CaN與肌肉收縮元件聯(lián)系起來，并且還為調(diào)節(jié)肌肉活動(dòng)性的潛在配體，研究證明CS不僅能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)控制肌纖維分化及發(fā)育過程，且參與鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)途徑。因此，在橫紋肌中CS作為CaN的特異性催化底物并具有調(diào)控其功能的作用，同時(shí)還參與Z線形成及其結(jié)構(gòu)的維持。
　

3、　 本實(shí)驗(yàn)利用酵母雙雜交技術(shù)篩選豬骨骼肌中CS-2互作蛋白，深入研究CS-2在豬骨骼肌纖維形成和信號(hào)通路調(diào)控中的功能，將有助于了解豬肌纖維形成機(jī)理，不僅為豬肉生產(chǎn)提供了分子理論，還為豬品種的改良提供了試驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)為深入研究心肌肥大及肌營(yíng)養(yǎng)不良等疾病提供了一定的理論基礎(chǔ)。主要研究成果如下：
　　 1．利用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)的方法克隆得到了豬的CS-2基因，并克隆到pGBKT7誘餌表達(dá)載體中，獲得了有表達(dá)活性且無毒性的pG

4、BKT7-CS2誘餌表達(dá)載體。
　　 2．分離、純化了豬骨骼肌組織的ds cDNA，將純化的cDNA及pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞。成功地構(gòu)建了豬骨骼肌cDNA文庫(kù)。
　　 3。將誘餌載體轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞中，并與文庫(kù)混合進(jìn)行酵母雙雜交，初步篩選到與CS-2互作的180個(gè)陽(yáng)性克隆。
　　 4．經(jīng)PCR鑒定、酶切、測(cè)序及結(jié)果分析，獲得了3個(gè)感興趣的互作蛋白，其中骨骼肌α-1-肌動(dòng)蛋