用酵母雙雜交技術(shù)篩選PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白.pdf

1、催化DNA雙鏈解開的酶是解螺旋酶，在幾乎所有的核酸代謝過程（包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)）中都有重要作用。DNA解螺旋酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)中存在一些高度保守的氨基酸序列，被稱作解螺旋酶模序（helicasemotif）。
　　PIF1解螺旋酶家族是5'至3'解螺旋酶，在從酵母到人的進(jìn)化中非常保守。在酵母中Pif1解螺旋酶的作用包括DNA修復(fù)、端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制及遺傳穩(wěn)定性維持。人PIF1解螺旋酶功能所知甚少，在我們的前期研究中

2、，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PIF1家族蛋白在其解螺旋酶模序的上游—PIF1蛋白的N-末端在進(jìn)化中也很保守，我們將其命名為PINT功能域(PIF1N-terminal，domain),我們研究還發(fā)現(xiàn)PINT功能域，具有使單鏈DNA退火形成雙鏈的能力，且對(duì)整個(gè)解螺旋酶活性的調(diào)節(jié)具有重要作用。
　　本課題擬在已有工作的基礎(chǔ)上，利用酵母雙雜交（yeasttwo-hybridssystem）技術(shù)，尋找與PIF1相互作用的靶蛋白或上游信號(hào)分子

3、，以期進(jìn)一步明確人PIF1解螺旋酶在體內(nèi)可能的生理功能。
　　我們分別用PIF1的PINT功能域（PIF1N）和PIF1的解螺旋酶模序（PIF1C）作為誘餌，用酵母雙雜交系統(tǒng)分別篩選人HeLa文庫(kù)，以尋找與各個(gè)功能域相互作用的蛋白。誘餌片段由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增后連入酵母表達(dá)質(zhì)粒pGB，測(cè)序檢測(cè)pGB-Bait質(zhì)粒，正確后轉(zhuǎn)入酵母菌Y190。再用β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）顯色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘餌蛋白是否有自激

4、活，確定無(wú)自激活后將人Hela文庫(kù)轉(zhuǎn)入能夠穩(wěn)定表達(dá)誘餌蛋白的酵母菌株中，用缺陷平板（SD/-Leu-Trp-His+3AT）高強(qiáng)度篩選，將得到的陽(yáng)性菌落擴(kuò)增抽質(zhì)粒。然后，將抽提的質(zhì)粒與pGB-Bait共轉(zhuǎn)化到Y(jié)190，進(jìn)一步確認(rèn)初篩為陽(yáng)性的克隆。最后用生物信息學(xué)來(lái)分析篩選呈陽(yáng)性克隆的文庫(kù)質(zhì)粒。
　　最終，以pGB-PIF1N為誘餌蛋白篩選人Hela文庫(kù)，我們得到15個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析得到3條陽(yáng)性基因：CCN