肺炎克雷伯桿菌的分離鑒定及其對小鼠的致病性研究.pdf

1、肺炎克雷伯桿菌（Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae，KP）是自然界常在菌，屬條件致病菌。它可引起急性人畜共患傳染病，該病常發(fā)生于豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、貂、熊貓、等多種家畜、家禽及野生動物。同時也是造成無特定病原體動物(specificpathogenfreeanimals，SPF)污染的主要微生物之一。對于實驗大、小鼠，尤其是當機體免疫功能下降或處于應(yīng)激狀態(tài)時（不良環(huán)境、進行動物實驗時），常因感染肺炎克

2、雷伯桿菌而影響實驗動物質(zhì)量及干擾動物實驗，甚至因大批動物死亡而造成損失，嚴重影響到教學及科研研究。
　　國家標準(GB14926-2001)規(guī)定，肺炎克雷伯桿菌是SPF級實驗大、小鼠必須檢測并排除的病原體。常規(guī)檢測需要采樣、培養(yǎng)、染色、生化反應(yīng)等多個實驗步驟，要數(shù)天才能出結(jié)果，而且工作量大。為了能滿足SPF級實驗動物肺炎克雷伯桿菌快速、高通量檢測的迫切要求，特進行本課題的研究。
　　本研究結(jié)合微生物學、病理學等方法，利用聚合

3、酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)檢測小鼠肺炎克雷伯桿菌，通過試驗的特異性、敏感性測定及臨床樣本的檢測、驗證，首次建立了快速、精確檢測小鼠肺炎克雷伯桿菌基因的方法，為SPF級實驗小鼠微生物質(zhì)量控制，及肺炎克雷伯桿菌感染臨床診斷提供一種新的有效工具。
　　根據(jù)肺炎克雷伯桿菌phoE基因的序列，設(shè)計并合成一對特異性的引物，利用PCR技術(shù)擴增phoE基因片段，對KP和鏈球菌（Streptococcus）、

4、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、沙門氏菌（Salmonella）、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、巴氏桿菌（Pasteurella）等其他非KP菌株提取DNA進行PCR擴增。KP的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)特異性DNA擴增片段，而其他非KP均未出現(xiàn)擴增片段，該PCR體系能檢測出107pgKP-DNA，從提取DNA到PCR擴增及電泳結(jié)束僅需4h。用PCR對123份臨床樣品進行了檢測，檢出率為2.44％(3/1

5、23)，與細菌學檢查結(jié)果的符合率為99.19％。
　　本研究采用生化試驗結(jié)合PCR方法等從疑似KP感染的患鼠中分離出的一株細菌進行鑒定，確定為肺炎克雷伯桿菌KP(KPm0912)。用分離菌株KPm0912和標準菌株KP1300分別接種ICR小鼠，建立了KP感染的小鼠動物模型，從臨床癥狀、大體病理變化、細菌學檢查和組織病理學四個方面進行研究，探討了KP的致病性。KPm0912對ICR小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為1.1×105CFU

6、/ml;KP1300對ICR小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為1.3×106CFU/ml。感染鼠發(fā)生皮下膿腫;胸腔內(nèi)出現(xiàn)膠凍樣滲出，肺臟淤血，水腫;肝、脾等實質(zhì)器官可見不同程度的腫脹，充血以及漿膜面出現(xiàn)膿性滲出物。在病理組織切片中，肺、肝、脾等組織中均可見大量炎性細胞浸潤。
　　以上試驗結(jié)果表明，本研究建立的PCR方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。該方法操作簡單，便于疾病發(fā)生時的快速診斷和流行病學調(diào)查，適合SPF級實驗