貂源綠膿桿菌的分離鑒定及其致病性研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來，山東省毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，目前已成為我國毛皮動物養(yǎng)殖第一大省，毛皮動物飼養(yǎng)量約占全國的二分之一。但是隨著我省毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的提高，毛皮動物的發(fā)病率持續(xù)上升，疫病防控形勢日趨嚴(yán)峻，疫病成為制約毛皮動物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，給毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。水貂出血性肺炎是嚴(yán)重妨礙水貂養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病之一，且疫情日趨嚴(yán)重。綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa

2、)又稱銅綠假單胞菌，是引起水貂出血性肺炎的病原之一，為了有效的防控水貂出血性肺炎，應(yīng)揭示闡明綠膿桿菌對水貂的致病性。本研究采用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定技術(shù)，對43份患出血性肺炎的水貂肺組織進(jìn)行了綠膿桿菌的分離鑒定，同時選擇綠膿桿菌代表菌株，建立綠膿桿菌致病性研究動物模型，來闡明綠膿桿菌的致病性。
　　1.綠膿桿菌的分離鑒定
　　2013年，在山東省諸城、文登、臨沂等地采集了43份患出血性肺炎的水貂肺組織。通過常規(guī)細(xì)菌分離技術(shù)對這43

3、份病料進(jìn)行了細(xì)菌分離培養(yǎng)，并采用形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)與16SrDNA測序等方法，對分離到的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果，分離到的5株細(xì)菌，均為綠膿桿菌，分別命名為F1、F5、F6、F8、F10，分離率為11.6％。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，5株綠膿桿菌均對青霉素、紅霉素、卡那霉素耐藥。16SrDNA序列同源性分析結(jié)果表明，5株綠膿桿菌與14株參考菌株間的核苷酸同源性為80.9％～100％，5株綠膿桿菌之間的核苷酸同源性為98.9％～99.7％;

4、系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，F(xiàn)5、F6、F8、F10與F1均在同一個大的分支上。
　　2.貂源綠膿桿菌的致病性研究
　　首先以F1株作為代表菌株，對小鼠進(jìn)行腹腔接種，建立綠膿桿菌對小鼠的致病性研究動物模型。將30只健康小鼠隨機(jī)分成6組，隔離飼養(yǎng)，每組5只。第1-5組小鼠分別腹腔接種菌落數(shù)為6.4×107CFU、6.4×106CFU、6.4×105CFU、6.4×104CFU、6.4×103CFU的F1菌液，第6組小鼠作為陰性對照。攻毒

5、后對實(shí)驗(yàn)小鼠連續(xù)觀察7天，記錄小鼠的臨床癥狀，對在實(shí)驗(yàn)期間死亡的小鼠進(jìn)行剖檢，采集心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行細(xì)菌的分布檢測及病理組織學(xué)檢查。結(jié)果，第1、2組小鼠在接種后12h-18h內(nèi)全部死亡，小鼠的心、肝、脾、肺、腎均有不同程度地出血，尤以肺部病變更為嚴(yán)重;病理組織學(xué)檢查可見小鼠心肌出血、肝細(xì)胞壞死、脾臟有大量炎性細(xì)胞、肺臟出血、肺泡壁增厚、腎間質(zhì)有紅細(xì)胞;在上述器官中均分離到了綠膿桿菌，在小鼠肺部含量最高，脾臟中含量最低;測得F1對小鼠

6、的LD50為1.6×106CFU/mL。小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果表明綠膿桿菌對小鼠具有較強(qiáng)的致病力。
　　以F1株作為代表菌株，對水貂進(jìn)行鼻腔接種，建立綠膿桿菌對水貂的致病性研究動物模型。將20只健康3月齡水貂分成5組，隔離飼養(yǎng)，每組4只。第1-4組分別鼻腔接種菌落數(shù)為1.6×108CFU、1.6×106CFU、1.6×104CFU、1.6×102CFU的F1菌液，第5組水貂為陰性對照，攻毒后連續(xù)觀察14天，對實(shí)驗(yàn)期間死亡的水貂和實(shí)驗(yàn)結(jié)

7、束時撲殺的所有水貂進(jìn)行剖檢，采集其心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行病理組織學(xué)檢查及細(xì)菌分離。結(jié)果，第1組水貂在人工感染后20h-44h內(nèi)全部死亡，剖檢可見死亡水貂的肺部嚴(yán)重出血、脾臟腫大，在其心、肝、脾、肺、腎中均分離到了綠膿桿菌。病理組織學(xué)檢查可見心肌纖維出血、肝細(xì)胞變性、脾臟出血壞死、肺出血、間質(zhì)增厚。測得F1對水貂的LD50為3.2×107 CFU/mL;其他人工感染組在接種后的第1-3d表現(xiàn)精神不振、食欲下降等臨床癥狀，但自攻毒后第4d恢