柔嫩艾美耳球蟲HF株的分離鑒定及其致病性研究.pdf

1、雞球蟲病是一種由艾美耳屬球蟲引起的呈世界性分布的寄生蟲病，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雞球蟲種類多，臨床多呈混合感染，其中致病性最強(qiáng)的是柔嫩艾美耳球蟲。本研究通過(guò)對(duì)瓊脂分離單球蟲卵囊方法進(jìn)行改進(jìn)，建立了球蟲單卵囊膠囊分離技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)成功地分離出一株球蟲，即柔嫩艾美耳球蟲合肥(HF)株，并對(duì)其致病性進(jìn)行了研究。 首先，從合肥市肥西縣選擇具有球蟲病典型癥狀的病雞，取其盲腸內(nèi)容物，用沉浮法收集柔嫩艾美耳球蟲的野外混合株，加入適量的

2、2.5％重鉻酸鉀溶液，置于27℃恒溫箱中培養(yǎng)。查閱有關(guān)資料，對(duì)球蟲單卵囊分離方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一種新的球蟲單卵囊分離方法，即球蟲單卵囊膠囊分離技術(shù)：用2％瓊脂塊分離到一個(gè)球蟲卵囊后，用膠囊封好，制成單卵囊膠囊。將膠囊經(jīng)口接種8只5日齡無(wú)球蟲雛雞，進(jìn)行單卵囊膠囊人工感染試驗(yàn)。從第4天起，每天收集糞便，檢查卵囊排出情況，第12天剖殺全部雛雞。結(jié)果，8只雞中有3只感染成功，感染成功率為37.5％。 其次，對(duì)所分離到的蟲株進(jìn)行形態(tài)學(xué)

3、鑒定。將上述單卵囊后代經(jīng)12日齡無(wú)球蟲雛雞增殖兩代，對(duì)連續(xù)兩代卵囊進(jìn)行形態(tài)觀察，測(cè)得第一代(150個(gè))卵囊的大小為16.8～24.6μm×16.1～20.7μm，平均大小為21.24μm×18.14μm。卵形指數(shù)為1.17。孢子囊大小為10.10～12.95μm×4.40～7.25μm，平均大小為11.60μm×5.99μm。第二代(150個(gè))卵囊的大小為17.6～23.3μm×15.5～20.5μm，平均大小為21.11μm×18.0

4、4μm，卵形指數(shù)為1.17。孢子囊大小為10.10～12.95μm×4.60～7.25μm，平均大小為11.59μm×6.01μm。對(duì)兩次測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(F檢驗(yàn))，其結(jié)果差異不顯著，而且第二代球蟲的寄生部位和病理變化與第一代相同，結(jié)果都符合柔嫩艾美耳球蟲的特征，因此初步鑒定本試驗(yàn)分離的球蟲為柔嫩艾美耳球蟲，暫命名為柔嫩艾美耳球蟲合肥(HF)株。 再次，采用飽和食鹽溶液濃縮卵囊，高速組織勻漿機(jī)破碎卵囊，用基因組抽提試劑

5、盒提取卵囊基因組。參照Schnitzler,B.E.等設(shè)計(jì)的引物：5'-AATTTAGTCCATCGCAACCCT-3，；5'-CGAGCGCTCTGCATACGACA-3'進(jìn)行PCR反應(yīng)，成功擴(kuò)增出278bp的特異性片斷。對(duì)擴(kuò)增片斷進(jìn)行克隆測(cè)序，并在網(wǎng)上進(jìn)行blast分析，表明所擴(kuò)增的基因序列與已報(bào)道的柔嫩艾美耳球蟲標(biāo)準(zhǔn)株基因序列有高度同源性。 最后，將柔嫩艾美耳球蟲HF株感染雛雞，并從臨床癥狀、病變積分、病理變化等方面進(jìn)行致

6、病性分析。結(jié)果顯示：當(dāng)接種1.0×104個(gè)卵囊時(shí)就引起雛雞死亡，致死率為10％；接種2.0×104個(gè)卵囊時(shí)，致死率為20％；接種4.0×104個(gè)卵囊時(shí)致死率為30％；接種8.0×104個(gè)卵囊時(shí)致死率為70％；接種1.6×105個(gè)卵囊時(shí)致死率達(dá)90％。表明隨著卵囊接種量的增多，雛雞死亡率也隨之增高。說(shuō)明柔嫩艾美耳球蟲HF株的致病力很強(qiáng)。 綜上所述，本研究成功地建立了一種新的球蟲單卵囊分離技術(shù)，應(yīng)用此技術(shù)分離到一株柔嫩艾美耳球蟲，對(duì)