柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4功能特性的初步研究.pdf

1、本文以對雞危害最為嚴(yán)重的E. tenella為研究對象，對E. tenella新基因EtCDPK4特性、酶活性及在E. tenella發(fā)育過程中所執(zhí)行的功能進(jìn)行了研究和分析，為探討E. tenella入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制和研制高效、安全的抗球蟲疫苗和新藥物奠定基礎(chǔ)。
　　1．柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　利用3’-和5’-RACE技術(shù)獲得EtCDPK4的全長cDNA序列，該序列大小是2499 b

2、p，包括5’-端185 bp UTR序列，不含有CAAT和TATA序列；3’-端UTR序列，長511 bp，含Ploy（A）尾，沒有典型AATAAA序列；ORF長1803 bp，編碼600個氨基酸，預(yù)測分子量68.3 kDa；對EtCDPK4編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、疏水性、信號肽、理化性質(zhì)、抗原位點(diǎn)和保守功能模塊進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示：該基因編碼蛋白沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，可能有16個抗原位點(diǎn)，推測具有良好抗原性。功能結(jié)構(gòu)域分析EtCDPK4可

3、能含2個N-端糖基化位點(diǎn)，3個N-端豆蔻酰化位點(diǎn)，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，10個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，5個EF-Hand模體Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該基因編碼蛋白具有CDPKs家族成員特征性保守結(jié)構(gòu)域。利用qRT-PCR檢測EtCDPK4在E. tenella4個不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平差異，結(jié)果表明EtCDPK4在E. tenella孢子化卵囊和子孢子階段均有轉(zhuǎn)錄，且子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平最高，與孢子化卵囊階段相比差

4、異極顯著。
　　2．柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4重組蛋白表達(dá)及其特性的初步研究
　　將EtCDPK4連接到原核表達(dá)載體pColdⅠ中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組蛋白His-EtCDPK4（rEtCDPK4）。利用Ni柱親和層析純化rEtCDPK4，純化的可溶性蛋白免疫新西蘭大白兔獲得兔抗重組蛋白多克隆抗體 IgG，經(jīng) western-blot分析表明rEtCDPK4具有

5、良好的抗原性。利用IFA技術(shù)對EtCDPK4天然蛋白在球蟲入侵DF-1細(xì)胞后不同發(fā)育階段分布和定位進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該蛋白主要位于E. tenella子孢子和第二代裂殖子核前端膜表面；當(dāng)子孢子入侵DF-1細(xì)胞12 h后，蛋白主要位于蟲體頂端和帶蟲空泡膜上，此時表達(dá)量極速增加；子孢子入侵DF-1細(xì)胞36 h后，表達(dá)量下降，主要位于滋養(yǎng)體邊緣；蟲體剛發(fā)育至未成熟裂殖體時，蛋白表達(dá)量迅速增加，蛋白均勻分布于整個蟲體，當(dāng)蟲體發(fā)育為中等階段未成

6、熟裂殖體時，表達(dá)量降低，發(fā)育為成熟裂殖體時，表達(dá)量又迅速上升，綠色熒光強(qiáng)度變強(qiáng)變亮。E. tenella子孢子入侵DF-1細(xì)胞體外抑制實(shí)驗(yàn)顯示，使用兔抗rEtCDPK4多克隆抗體處理E. tenella子孢子后，與正常兔血清IgG對照組相比子孢子入侵DF-1活力顯著減弱，且隨著抗體處理子孢子濃度不斷增大，入侵細(xì)胞能力逐漸降低，當(dāng)抗體濃度為400μg/mL時，抑制率高達(dá)52％。通過免疫印跡檢測E. tenella4個發(fā)育階段EtCDPK4

7、翻譯水平結(jié)果顯示，EtCDPK4蛋白在E. tenella4個不同發(fā)育階段均有翻譯，但在E. tenella第二代裂殖子中翻譯水平最高。
　　3．柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4催化活性的初步研究
　　通過構(gòu)建體外磷酸化反應(yīng)體系，探究了可溶性rEtCDPK4的酶催化活性特性、不同Ca2+濃度對rEtCDPK4酶活性大小影響以及rEtCDPK4酶活性特異性抑制劑的體外篩選和體內(nèi)臨床驗(yàn)證。結(jié)果表明，rEtCDPK4酶活性大小在0.

8、87 nmol?min-1?ml-1左右；rEtCDPK4蛋白激酶活性正常發(fā)揮要完全依賴于酶活反應(yīng)體系中Ca2+，當(dāng)Ca2+濃度為0時，rEtCDPK4沒有任何酶活性，不能夠使底物短多肽磷酸化，隨著酶活反應(yīng)緩沖溶液中Ca2+濃度不斷升高，可以明顯看到rEtCDPK4的酶反應(yīng)催化活性是不斷的增強(qiáng)的；通過體外磷酸化酶活性反應(yīng)的篩選和E. tenella子孢子體外入侵抑制實(shí)驗(yàn)的臨床驗(yàn)證，篩選出4種效果較好的EtCDPK4酶催化活性抑制劑，分別

9、是：W-7、H-7、H-89以及Myristoylated Protein Kinase Peptide Inhibitor。這4種抑制劑都能夠在一定程度上有效抑制E. tenella子孢子入侵DF-1細(xì)胞的能力。
　　4．柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4相互作用底物的篩選
　　為了獲得 E. tenella子孢子或第二代裂殖子入侵階段 EtCDPK4的相互作用蛋白，構(gòu)建了EtCDPK4的BD誘餌質(zhì)粒，利用酵母雙雜交技術(shù)將BD

10、誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4篩選E. tenella子孢子或第二代裂殖子酵母雙雜交cDNA文庫獲得與EtCDPK4相互作用的底物蛋白。將構(gòu)建的BD誘餌蛋白進(jìn)行自激活活性、細(xì)胞毒性及誘餌蛋白c-Myc-EtCDPK4是否在宿主酵母菌中表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，構(gòu)建的酵母BD誘餌蛋白沒有自激活活性、細(xì)胞毒性且在酵母中能表達(dá)，因此可用于酵母雙雜交篩選。通過使用BD誘餌蛋白對E. tenella子孢子或第二代裂殖子酵母雙雜交cDNA文庫的

11、篩選，在SD/-Ade/-Trp/-His/-Leu/X-α-GAL缺陷性固體培養(yǎng)基上共獲得88個藍(lán)色酵母單克隆菌落，其中80個成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10進(jìn)行測序；序列經(jīng)BLAST分析后，得到10個可能與EtCDPK4相互作用的蛋白，包括未知基因9個，已知基因1個，未命名蛋白6個，4個已報(bào)道蛋白，即EtSerpin，Etm094G10，Etm109G06，EtGMP。利用Co-IP的方法驗(yàn)證了EtCDPK4和EtSerpin相互作用關(guān)系