柔嫩艾美耳球蟲(chóng)棒狀體頸部蛋白2(EtRON2)基因的克隆表達(dá)及功能初步研究.pdf

1、棒狀體（rhoptry）是存在于頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)的一種特殊亞細(xì)胞器，與微線（microneme）、類錐體（conoid）等一起共同形成其分類上的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)-頂端復(fù)合體（Apical complex）。對(duì)瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)等的深入研究表明，在頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)入侵過(guò)程中，通過(guò)蟲(chóng)體前端與宿主細(xì)胞膜之間形成一個(gè)活動(dòng)的連接區(qū)域--運(yùn)動(dòng)結(jié)合體（Moving Juction，MJ），并介導(dǎo)蟲(chóng)體入侵過(guò)程的早期機(jī)制，已知微線分泌的頂膜抗原（Apical Membrane

2、Antigen1，AMAl）及部分棒狀體頸部蛋白（RON2、RON4、RON5）是形成MJ復(fù)合物的重要成分或功能分子。然而迄今對(duì)艾美耳球蟲(chóng)棒狀體蛋白和棒狀體頸部蛋白尚未進(jìn)行任何研究。
　　 本研究利用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)技術(shù)注釋拼接得到柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella）棒狀體頸部蛋白2（EtRON2）的基因序列，以預(yù)測(cè)的序列設(shè)計(jì)特異性引物，以.E.tenella子孢子總RNA為模板，用RT-PCR的方法擴(kuò)增出E

3、tron2全長(zhǎng)ORF；并以此全長(zhǎng)ORF序列設(shè)計(jì)特異性引物，以E.tenella子孢子的基因組DNA為模板，用PCR方法成功擴(kuò)增出Etron2ORF片段的gDNA序列片段。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，Etron2ORF片段的gDNA含有11個(gè)內(nèi)含子；ORF全長(zhǎng)為4020bp，編碼一包括5’端信號(hào)肽的全長(zhǎng)為1339個(gè)氨基酸的多肽片段，與其他物種RON2的氨基酸序列相似性為15％-41％。
　　 通過(guò)生物信息學(xué)方法解析EtRON2的抗原性

4、及其疏水性，以此對(duì)Gene Bank和E.tenella基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比對(duì)，選擇EtRON2特異性的潛在抗原表位。以其序列設(shè)計(jì)引物，特異性擴(kuò)增編碼抗原表位的序列片段（EtRON2Ag，序列長(zhǎng)度為228bp，編碼925-1152位點(diǎn)的76個(gè)氨基酸），構(gòu)建pMAL-c2x-EtRON2Ag重組子，于E.coli Rosseta（DE3）中重組表達(dá)并免疫小鼠制備特異性抗體，利用激光共聚焦顯微鏡研究EtRON2在E.tenella子孢子內(nèi)

5、的免疫熒光亞細(xì)胞定位；分別收集感染E.tenella后5、7、10、15、20日雞的血清，以EtRON2Ag抗原包被ELISA板，檢測(cè)收集血清中Anti-EtRON2Ag的效價(jià)。結(jié)果顯示，EtRON2定位于E.tenella子孢子的頂端；ELISA法檢測(cè)感染E.tenell10天后雞血清中EtRON2Ag的抗體效價(jià)為1:50，初步表明E.tenella在感染雞體過(guò)程中可以分泌表達(dá)EtRON2蛋白，并誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。
　　 選取E.

6、tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；選擇Etact加作為參照基因，Etron2和Etama為目的基因，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，分析E.tenella生活史中不同發(fā)育階段Etam2和Etama轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果顯示，Etron2在未孢子化卵囊中轉(zhuǎn)錄水平最高，然后分別是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子，說(shuō)明可能在未孢子化階段基因被儲(chǔ)備，以便于入侵時(shí)大量分泌；Etama

7、在子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平最高，其他階段都相對(duì)很低，說(shuō)明子孢子階段該基因的表達(dá)蛋白分泌最旺盛；比較Erton2和Etama轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，子孢子階段Etama轉(zhuǎn)錄水平更高，提示EtAMA蛋白在子孢子入侵宿主細(xì)胞時(shí)具有更重要或更長(zhǎng)時(shí)間的作用。
　　 選擇不同的原核表達(dá)載體（pET-32a（+）、pMAL-c2x、pCold-TF和pCold-SUWO），利用不同表達(dá)菌（E.coli Rosseta（DE3）、E.coli BL21）重組表